脂肽类化合物surfactin合成调控的机理研究开题报告

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1. 研究目的与意义

植物病害是影响农业生产的主要因素之一 ,然而 ,目前世界各国对植物病害的防治主要是使用化学药剂，例抗生素,但长期使用会给水土流失、肥力下降、给世界带来严重污染。80多年来植物病害生防微生物已涉及真菌、放线菌、细菌乃至病毒 (噬菌体 )等种群。目前,应用较多的生防细菌主要有芽孢杆菌 、假单孢杆菌、土壤放射杆菌等，其中，芽孢杆菌是翘首。由于枯草芽孢杆菌具有生长快、营养简单以及 产生耐热、抗逆芽孢等突出特征,因此 ,芽孢杆菌现已成为一种理想的生防细菌。芽孢杆菌（Bacillus）是杆状革兰氏阳性菌，好氧或兼性厌氧，通常生活在土壤或定殖在植物根际中，具有广泛的宿主范围，生命力强，能产生丰富的代谢产物，具有抑制多种植物病原微生物的作用。本实验所用的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）FZB42即是一株遗传背景清晰的革兰氏阳性芽孢杆，与生物表面活性剂的合成与调控密切相关。Surfactin是芽孢杆菌属不同菌株代谢产生的一种脂肽，是研究较为深入的微生物源AMPs之一。研究表明，Surfactin具有广谱高效的抗菌活性，不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、霉菌等多种细菌或真菌具有抗菌用，而且对病毒、支原体和原虫等也具有显著的抑制效果。但Surfactin抗菌的具体机制尚不明确，普遍认为 Surfactin的抗菌活性与其理化性质密切相关。很多学者试图通过提出不同假说，建立相关模型及开展试验来解释 Surfactin的抗菌作用进程。鉴于其抗菌过程的复杂性,目前尚不明确其是通过哪一种途径或者多种途径共同作用而发挥抗菌效果。

2. 国内外研究现状分析

Surfactin最早由Arima等于 1968年在枯草芽孢杆菌IFO3039发酵液中发现。Surfactin由1个手性序列为LL-DLLDL的七肽和1个含13到15个碳原子的 β－羟基脂肪酸构成。Surfactin长脂肪酸链及肽链上的 L－亮氨酸2（ L-Leu2）、D－亮氨酸3（ D-Leu3）、L－缬氨酸4（L-Val4） 、D－亮氨酸6（D-Leu6）、L－亮氨酸7（L-Leu7）构成其亲油基团，环链骨架与L－谷氨酸1（L-Glu7）和 L－天冬氨酸5（L-Asp5）2个酸性氨基酸残基构成亲水基团。研究表明，Surfactin对病原菌作用的细胞靶位点是细胞膜。目前，关于Surfactin与微生物的细胞膜之间的作用机制主要有以下2种假说：1)去垢剂假说，Surfactin将带负电的肽环伸入水相，将其非极性的脂肪酸链插入到细胞膜磷脂分子层，达到一定浓度时，会产生类去垢剂的效应，使 细胞膜产生裂缝并分离，胞内物质外泄，最终引起细胞生长受到抑制或死亡。2）孔洞假说，该假说将Surfactin与生物膜作用简要分为 3个过程：1）Surfactin通过与膜之间的疏水作用力插入膜表面；2）由于Surfactin带负电荷的氨基酸和脂质头部产生电荷相互排斥，造成膜弯曲；3）膜体极不稳定而产生类似胶束的结构造成膜崩解。添加低浓度的Surfactin时其会和微浆菌的细胞膜结合，造成膜上孔洞的发生进而造成膜内外渗透压失衡使细菌死亡，而添加高浓度的Surfactin则会导致微浆菌整个细胞膜瓦解。

脂肽主要可分为以下几类：表面活性素类（surfactin），帕米拉素（pumilacidin）伊枯草素类（iturin），芬芥素（fengicin），大侧柏素（plipastatin），地衣素（lichenysin），多粘菌素（polymixin）等。按脂肽的结构特征可以将其分为环状脂肽（cyclic lipopeptide）和线形脂肽（linearlipopeptide）两大类。脂肽分子是由亲水肽键和亲油性脂肪烃链两部分所组成，亲水基由脂肽分子中多个氨基酸肽链组合形成，亲油基是由脂肪烃链形成，是由β-羟基长链脂肪酸或者β-氨基和小肽链或小肽环所构成的同类化合物。脂肽类抗生素的作用机制有四。一，引起膜结构的改变或损伤。二，抑制细胞壁的合成。三，诱导细胞凋亡作用，既能诱导ROS的产生，又能诱导JNK和ERK的磷酸化，且两者均与MCF-7细胞凋亡有关。四，对细胞核染色体、DNA及蛋白质的合成有抑制作用，从而导致细菌细胞快速死亡。

3. 研究的基本内容与计划

生物表面活性剂的产生菌株的大部分的筛选方法基于表面活性剂的物理效应，也可从菌株干预疏水界面的能力来进行探讨。基本均采用定性方法筛选。评价生物表面活性剂的表面活性可以用空气/水之间的表面张力和油/水界面的界面张力来表示；或者用乳化液的不稳定性和亲水-亲油值来表示；或用生物表面活性剂的效率-临界胶束浓度（cmc）来表示。而测定表面活力是最直接的筛选方法，适用于初步筛选。可用以下方法测定：1.ctab琼脂培养基2.血平板法3.油扩散法4.油平板筛选油平板 脂肽定性分析方法则有：1.聚丙烯酰胺凝胶电泳2.薄层层析(tlc)3.红外光谱分析（ft-ir）

（1）2019.2.27―2019.3.5：阅读文献。熟悉掌握基本概念（解淀粉芽孢杆菌， surfactin），基本实验流程，和研究意义。

（2）2019.3.5―2019.5.20：完成解淀粉芽孢杆菌fzb42 surfactin合成过程调控机制的研究。

4. 研究创新点

最近研究表明，脂肽抗生素有助于产生菌在植物根部的定殖，增强其生态环境适应性，还有助于激发植物防御机制。目前，越来越多抗菌脂肽的合成机制得以阐明，大量相关基因被克隆、分析，特别是一些芽孢杆菌全基因组测序的完成，提供大量抗生素合成及调控的遗传信息，但仍不知是具体哪个遗传片段产生的。