D-阿洛酮糖异构酶的筛选和催化性质研究开题报告

1. 研究目的与意义（文献综述包含参考文献）

随着肥胖、糖尿病等代谢性疾病的发病率在全球范围急剧上升，人们对食品营养和健康等问题日益关注。

饮食中甜味剂的缺乏会影响生活质量，因此寻找合适的甜味剂替代品具有重要意义。

d-阿洛酮糖(d-psicose)在分类上属于己糖和酮糖，为d-果糖c-3位的差向异构体。

2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

研究或解决的问题：（1）生物信息学挖掘，筛选DPEase产生菌株；（2）克隆来源于微生物的DPEase基因，异源表达，重组酶分离纯化；（3）从最适反应温度、最适pH、最适金属离子及酶促反应动力学等方面进行酶学性质研究，判断筛选到的DPEase能否高效应用于合成D-阿洛酮糖。

研究手段：（1）在NCBI数据库中进行BLAST 分析，同源比对，筛选具有高同源性、未被报道的DPEase产生菌株；（2）PCR 扩增DPEase目的基因，与表达载体连接，转化大肠杆菌E. coli BL21（DE3）感受态细胞；（3）用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）对重组DPEase诱导表达，通过离心和细胞破碎获得粗酶液，用Ni-NTA柱分离纯化获得纯酶液，通过SDS-PAGE分析纯化结果并测定蛋白浓度；（4）以D-果糖为底物，通过HPLC对产物进行定性和定量分析；通过正交实验测定温度、pH、金属离子浓度对酶活力的影响；在底物浓度为一定范围内进行酶促反应动力学参数研究；（5）以D-果糖为底物进行生物转化实验，HPLC检测D-阿洛酮糖产物，分析筛选到的DPEase在D-阿洛酮糖生产中的潜力。