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1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1 本课题研究意义发酵肉制品的定义一般是指以某种畜禽肉为原料，在自然条件或者人工操作的条件下，肉通过特定有益微生物的发酵而形成的一类具有特殊风味、特殊色泽、特殊质地和具有较长保存期的肉制品。
发酵肉制品的主要特点是营养丰富、风味独特、保存期较长，并在加工过程中通过相关的微生物的发酵，使肉中的蛋白质被分解成氨基酸，提高了蛋白质对人体的吸收率[1-2]。
西藏地区由于其特殊的地理和气候环境，蕴藏着丰富而特有的生物种质资源。
2. 研究的基本内容和问题
1研究目标
通过研究西藏传统发酵肉制品中发酵剂的生长能力，发酵剂对病原菌的作用，发酵剂的环境耐受性，发酵剂的产香能力以及对发酵剂的安全性评价，对目前市场上正在使用的发酵剂进行评价，并找到潜在的安全、高效发酵剂。
2研究内容
3. 研究的方法与方案
1研究方法及实验方案
1.1菌株活化
1.1.1冻干粉的活化
开启菌种管，将冻干粉加入到10ml生理盐水中，摇匀，在37℃复水30min。用接种环蘸取生理盐水，转接到MRS固体培养基上，在36.5℃中恒温培养48h。挑选典型菌落在10mlMRS肉汤中，36.5℃培养24-36小时，再次接种到MRS固体培养基中，36.5℃恒温培养48h，在从平板中挑取单菌落即可。
1.1.2单核增生李斯特菌的活化
取100ul冻存液于5mlBHI溶液中，37℃培养15h，再取100ul菌液（第一次活化）于5mlBHI溶液中，37℃ 180r摇床4h。
1.1.3沙门氏菌的活化
取100ul菌株冻存液于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，转接至液体培养基中，37℃150r过夜培养，备用。
1.1.4金黄色葡萄球菌的活化
取100ul冻存液于TSB中，36℃培养，在划线到TSA平板中，培养24h，挑取单菌落备用。
1.1.5大肠杆菌O157的活化
取冻存液于LB液体培养基中, 37 ℃静置培养24 h, 然后将其接种于装有100 mL 液体培养基的250 mL三角瓶, 37 ℃, 摇床培养24 h。活化2 次即可, 置于4 ℃的冰箱中保存备用。
1.2乳酸菌的生长能力
将活化好的乳酸菌接种于MRS肉汤培养基中，在37 ℃条件下培养24h，用微生物生长曲线监测仪于波长600nm处检测OD值，观察培养时间与菌株生长的关系，绘制生长曲线。
1.3乳酸菌对致病菌作用
1.3.1乳酸菌对单核增生李斯特菌的作用
提前将BHI琼脂高温灭菌，趁热将琼脂倒在平板上；取200 ml活化好的单核增生李斯特菌培养液均匀涂布到平板上；将6mm牛津杯放置于平板上，内部加入100ml乳酸菌培养液，将平板于4℃下扩散4h，之后37℃培养24h，用游标卡尺测定抑菌圈直径的大小。
1.3.2乳酸菌对金黄色葡萄球菌的作用
将1.3.1中BHI琼脂换成TSA，单核增生李斯特菌换成金黄色葡萄球菌，其余操作步骤与1.3.1相同。
1.3.3乳酸菌对沙门氏菌的作用
将1.3.1中BHI琼脂换成牛肉膏蛋白胨固体培养基，单核增生李斯特菌换成沙门氏菌，其余操作步骤与1.3.1相同。
1.3.4乳酸菌对大肠杆菌O157的作用
将1.3.1中BHI琼脂换成LB固体培养基，单核增生李斯特菌换成大肠杆菌O157菌，其余操作步骤与1.3.1相同。
1.4乳酸菌的抗生素耐药性
根据待测菌株的生长情况选择对应的培养基，称量配制对应的MH琼脂培养基， MH琼脂培养基经过高温高压灭菌后，倒入平板，其中每个平板大约20ml的培养基，平板当天使用，或者使用封口膜将平板边缘封好，保存于 4℃条件下，使用前应当将平板置于37℃培养箱将其表面干燥后方可使用。将经过过夜培养的待测菌株稀释至麦氏比浊度为0.5的标准菌液浓度，校正好后的菌液浓度应该在15 min 之内接种完成，然后利用接种器均匀得将校正好后的菌液涂布于MH琼脂平板上，将接种菌液的平板在室温条件下放置干燥3~5 min。同时也应该接种金黄色葡萄球菌ATCC25923标注质控菌株来检验抗生素是否合格。根据CLSI 2011（Clinical Laboty StardInstitute）的规定，14种抗生素药片以3 cm的间隔被放置在涂布了乳酸菌的MH平板上，每个平板放置3片药片。具体包括：10 μg青霉素G, 10 μg氨苄西林, 30 μg万古霉素，15 μg红霉素, 30 μg四环素, 30 μg强力霉素, 30 μg米诺环素, 5 μg环丙沙星, 5 μg氧氟沙星, 300 μg呋喃妥因, 5 μg利福平, 30 μg氯霉素, 120 μg庆大霉素 300 μg链霉素。将琼脂平板置于适宜的温度下培养适当时间后观察结果，用游标卡尺量取琼脂平板上的抑菌圈直径，然后与对应的标准条件比较，判断待测菌株的药物敏感性。
菌株对8种抗生素的药敏性判断标准，见下表
表3 抗生素抗性的判断标准
| 抗生素 种类 | 纸片效 价/ug | 抑菌圈直径/mm | 质控菌株S.aureus ATCC25923 抑菌圈直径范围/mm | ||
| 抗性 | 中度敏感 | 敏感 | |||
| 氨苄青霉素 | 10 | ≤12 | 13～15 | ≥16 | 27～35 |
| 氯霉素 | 30 | ≤13 | 14～17 | ≥18 | 19～26 |
| 红霉素 | 15 | ≤13 | 14～17 | ≥18 | 22～30 |
| 新霉素 | 30 | ≤13 | 14～17 | ≥18 | — |
| 荼啶酮酸 | 30 | ≤13 | 14～17 | ≥18 | — |
| 链霉素 | 10 | ≤11 | 12～14 | ≥15 | 14～22 |
| 四环素 | 30 | ≤14 | 15～18 | ≥19 | 24～30 |
| 万古霉素 | 30 | ≤14 | 15～16 | ≥17 | 17～21 |
2技术路线
2.1乳酸菌的生长能力
| |
| 乳酸菌冻干粉的活化 |
| 600nm处检测OD值 |
| 绘制出生长曲线 |
2.2乳酸菌对病原菌的作用
| | |||
| |
| 乳酸菌冻干粉的活化 致病菌冻存液的活化 |
| 平板中倒好相应的固体琼脂 |
| 平板上均匀涂布好致病菌培养液 |
| 牛津杯中加入乳酸菌培养液 |
| 4℃培养4h后37℃培养24h |
| 用游标卡尺测定抑菌圈的大小 |
| 金黄色葡萄球菌ATCC25923冻干粉活化 |
| |
| 乳酸菌冻干粉的活化 |
| 每个平板分散放置3个含有不同抗生素的纸片 |
| 37℃倒扣培养24h |
| 用游标卡尺测量抑菌圈的直径，判断抗生素敏感性 |
3可行性分析
本项目依托国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，具备生物安全柜、培养基自动制备分装机、菌落计数器、高压灭菌锅等硬件设施，能够满足本项目相关研究的需求，保障项目的顺利实施。4. 研究创新点
本实验研究的发酵剂是从西藏传统发酵肉制品中提取的,具有与普通发酵剂不同的性质,比如耐低温,耐低压,耐高渗透压等特性,对这种发酵剂进行深入研究，可以在未来更好地使用具有特殊性质的发酵剂。
5. 研究计划与进展
2019.03.01—2019.04.01 实验准备阶段，购买好需要的试剂耗材
2019.04.02—2019.05.01 正式实验阶段
2019.05.02—2019.05.20 整理实验数据、完成论文撰写
