1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)
四环素类抗生素发现于20世纪40年代,20世纪50年代被用于人类疾病的治疗及畜牧业的生长促进剂,是最常见和最重要的抗生素之一[1]。
四环素类抗生素主要包括土霉素、金霉素、四环素、多西环素、美他环素等[2],临床中,医护工作者由于对各种抗菌药物的药理、药性不能做到充分、全面的了解。
对抗菌药物太过依赖及对其把握不足是这是造成临床中抗菌药物被滥用及抗菌药物耐药性增加的主要原因。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标:通过研究细菌对四环素的耐药机制,从失活酶的角度运用基因工程的方法,来研究四环素失活酶的耐药机制,把四环素类抗生素合理的将运用于临床,将药物的毒副作用降至最低,从而提高四环素的应用价值。
研究内容:进行四环素耐药基因的筛选,经过筛选后进行亚克隆的构建。
拟解决的关键问题:1、 亚克隆的构建 2、蛋白提取与纯化。
3. 研究的方法与方案
研究方法:一、 耐药阳性亚克隆的构建1.载体制备 :载体制备包括载体的酶切和去磷酸化。
载体酶切的构建好体系后的反应条件是30℃反应1h;然后65℃下反应20min。
(2)去磷酸化构建好体系后的反应条件是37℃反应30min; 然后进行琼脂糖凝胶电泳(电压130v,时间40min);切下marker和样品的一部分染色20min,通过凝胶成像仪来确定条带位置,然后进行切胶回收。
4. 研究创新点
运用单克隆以及四环素失活酶的诱变表达的方法来研究四环素的耐药机制。
5. 研究计划与进展
实验预期时间实验进展 实验进展内容2017.6-2017.8 确定四环素耐药机制的研究方向,查阅相关背景资料及研究进展.2017.9-2017.12 学习实验中具体所需的实验操作,分子生物学与蛋白质表达相关资料,完成文献综述,和导师确定具体细节。
2018.2-2018.3 进行四环素失活酶的具体研究内容以及蛋白质表达的机理及操作方法,完成开题报告2018.3-2018.4 进行单克隆的制备,完成四环素失活酶的诱导表达,完成中期报告2018.4-2018.5 独立自主完成四环素耐药机制相关内容的毕业实验,准备论文答辩
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