1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
本课题的意义：中链脂肪酸是指链长为6-12碳的脂肪酸，与普通食用油（链长大于12碳）相比，具有消化吸收快，不形成脂肪积累等特点，因而它特别适宜作治疗食品的原料、具有特殊营养的治疗食品。
可以通过运用β-氧化循环反向应用以乙酰辅酶a为前体来形成高效率的中链脂肪酸合成途径。
通过对大肠杆菌基因组上的5个基因序列的敲除，全面改造发酵菌株，干扰胞内乙酰辅酶a流向丙酮酸、乙醇等其他代谢产物途径，从而提高前体物质乙酰辅酶a含量，以提高脂肪酸产量。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标:大肠杆菌中链脂肪酸合成途径中，为了提高中链脂肪酸的产量，通过按顺序敲除大肠杆菌基因组上的idha、adhe、frda、pta、poxb这5个基因序列，全面改造发酵菌株，从而抑制乙酰辅酶a流向丙酮酸、乙酸、延胡索酸、乙酸、乙醇代谢产物通路，来提高前体物质乙酰辅酶a的含量，从而提高终产物中链脂肪酸的产量。
研究内容: 通过将pcas质粒转到大肠杆菌中，同时电转入同源臂template片段和ptarget质粒，即可达到敲除基因的目的。
敲除idha、adhe、frda、pta、poxb这5个基因序列，从而干扰乙酰辅酶a向丙酮酸、乙酸等其他代谢通路，以提高乙酰辅酶a含量，将合成的质粒转入到已敲除基因的菌株中，发酵后观察脂肪酸产量变化。
3. 研究的方法与方案
研究方法：将pcas质粒导入到待删除菌株中；然后合成sgrna引物，以ptarget全质粒为模板，通过全质粒pcr取代原来的20bp的序列；胶回收pcr后的ptarget，利用dpni酶消化后直接磷酸化，然后环化自连接，转化至jm109感受态细胞中；测序正确后提取ptarget质粒；根据基因组的序列，在待敲除基因上下游各选择500bp，融合pcr，获得重组的template，将获得的重组片段整合到t载体上，进行测序，扩增酶切后胶回收获得大量的template序列，先将含有pcas质粒的菌株培养到od600为0.2时，加入1%的1m阿拉伯糖进行诱导产生重组酶；诱导至od600达到0.6时，制作电转感受态；将获得的ptarget和template按照比例加入到感受态细胞中，进行电转化，将电转化细胞涂布到含有壮观霉素和kana的平板上，将长出的菌落做菌落pcr,用原始菌株作对照，若pcr片段比未删除的菌株短，则删除成功；确定删除成功后，挑取单菌落，添加iptg培养，可以消除ptarget质粒，涂板挑单菌落，获得ptarget被消除的菌株，然后用42度培养，涂板挑单菌落，获得pcas消除的菌株；将合成的质粒转入到已敲除基因的菌株中，发酵后观察脂肪酸产量变化。
技术路线：1）酶切：因从t载体上进行酶切，将质粒按同样的酶切位点进行酶切；2）胶回收：将切出来的正确基因片段回收；3）连接：将胶回收的基因片段和质粒片段连接成完整的质粒环；4）转化：将合成的质粒转入到已敲除基因的菌株中；5）发酵：将成功转化的工程菌活化发酵；6）检测脂肪酸产量：萃取发酵菌液中的脂肪酸，用高效气相质谱联用仪检测脂肪酸含量。
实验方案：实验前期确定脂肪酸前体物质乙酰辅酶a代谢途径，找到主要代谢途径，找出需要敲除的idha、adhe、frda、pta、poxb这5个基因，具体实验时我们利用基于cas9系统的基因编辑技术将这些基因进行敲除，抑制乙酰辅酶a向丙酮酸、乙醇等其他代谢产物通路，从而提高前体物质乙酰辅酶a含量以提高终产物脂肪酸的含量。
4. 研究创新点
基于cas9的多位点基因组编辑提供了一个高度灵活的和可设计的方法。
多位点的能力是基于cas9系统的另一个显著的优势，基于cas9的技术实现多位点基因组编辑和转录调控,同时避免冗长的逐步遗传操纵。
cas9系统的可用的位置更多，进行多位点的基因组编辑。
5. 研究计划与进展
研究计划：2016年10月01日-10月10日 论文选题，资料收集、整理、总结分析2016年10月10日-10月20日 实验的设计2017年02月20日-04月20日 实验的实施进行以及数据的整理与分析2017年04月20日-05月25日 论文的撰写预期进展：基于Cas9系统的无痕敲除技术，敲除大肠杆菌基因组上的5个基因，分别是：1、乙酰辅酶A流向丙酮酸途径：BL21△ldhA；2、乙酰辅酶A流向乙酸途径： BL21△pta、BL21△ldhA△pta；3、乙酰辅酶A流向延胡索酸途径： BL21△frdA、BL21△ldhA△pta△frdA；4、乙酰辅酶A流向乙酸途径： BL21△poxB、BL21△ldhA△pta△frdA△poxB；5、乙酰辅酶A流向乙醇途径： BL21△adhE、 BL21△ldhA△pta△frdA△poxB△adhE。
