1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1 研究意义
四环素类抗生素是一种广谱抗生素，由于抑菌效果好且成本低廉，曾经在医疗和农业方面得到广泛应用。但是随着使用数量和时间的增加，经突变或横向基因转移而获得四环素类抗生素耐药性的微生物种类越来越多，这使得耐药基因成为一类严重威胁人类健康和生命安全的新型环境污染物。因此，研究四环素类抗生素耐药机制对于控制耐药性的增长具有重要意义。
四环素解构酶修饰灭活四环素是四环素类抗生素耐药机制的一种，且目前只有唯一1种四环素解构酶被发现并被透彻研究。而本项目的研究对象是两个新型的四环素解构酶，通过对其异源表达，可以深入了解酶灭活机制，为四环素耐药机制的研究提供更多的支持。同时，越来越多四环素解构酶的发现暗示着，也许酶灭活机制具有广泛的存在，这也为四环素耐药性的防控提供了一个新的思路。
2. 研究的基本内容和问题
1 研究目标
目前，对四环素耐药机制的研究主要在外排泵机制和核糖体保护机制两方面，而对灭活四环素机制的研究很少，已发表的成果中只有四环素解构酶tet(x)一种。幸运的是，本实验室从自珠穆朗玛峰采集的土壤中筛选出两个具有四环素耐药性的基因，并且预测这两个基因的耐药机制为表达出四环素解构酶从而灭活四环素。本项目的研究目的是在异源宿主大肠杆菌中大量表达四环素解构酶，并对该酶做功能分析，进而为临床上四环素耐药机制和四环素解构酶的研究提供必要支持。
2 研究内容
3. 研究的方法与方案
1 研究方法及方案
1.1确定耐四环素阳性克隆的四环素mic值
按美国临床实验室标准委员会（clinical and laboratory standards institute, clsi）推荐的肉汤微量稀释法进行，对所筛选到的阳性克隆进行四环素的mic值测定，结果判定参照美国临床实验室标准委员会clsi标准。运用倍比稀释法将药物加入96孔板，并加入一定量的阳性克隆进行培养（同时设置阳性和阴性对照），观察各孔培养液中细菌的生长情况，以抑制细菌生长的药物最高稀释度作为测试药物的最小抑菌浓度（mic）。判断结果严格按照clsi发布的m31-a3标准来执行。判定结果分别以敏感、中介和耐药3种形式记录。
4. 研究创新点
四环素解构酶这一耐药机制在临床菌中极为少见，本课题组前期研究中应用宏基因组学方法从珠穆朗玛峰土壤文库中筛选得到两个新型四环素耐药基因，经序列比对推测为两个新型四环素解构酶基因，本项目将这两个功能基因进行异源表达，深入研究其体内及体外活性，并试解析其作用机理。为该种耐药机制的环境分布提供证据，并对临床菌中四环素耐药性监测提供新的思路。
5. 研究计划与进展
1 项目计划及进展
2016.9
确定耐四环素阳性克隆的四环素mic值
