紫背天葵叶片SOD酶基因克隆开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

紫背天葵，学名gynura bicolor(roxb. exw illd.)d.c，别名紫背菜、两色三七草、红背菜、观音菜^[1]，为菊科三七草属多年生宿根草本植物。其富含多种纤维素及多种微量元素^[2]、氨基酸^[3]、蛋白质^[4]、花色苷、黄酮类物质和挥发油等，是一种很好的集营养保健价值与特殊风味为一体的药食同源的特色蔬菜。因此近年来的研究也日渐深入。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase.sod)是一个金属酶家族，具有清除生物体代谢所产生的超氧自由基的特异性，能够有效防止生物分子被氧化^[5]。sod广泛存在于各种生物体内，是生物执行体防御机能最重要的酶之一，sod根据其酶活性中心辅基结合金属离子的不同，至少可以分为cu/zn-sod、mn-sod和fe-sod^[6]。其中 cu/zn-sod 在活性氧清除的酶系中尤为重要^[7], 与植物的抗旱^[8]、抗寒^[9]、耐盐碱等多种抗逆性关系密切^[10-11]。

近二、三十年来，关于紫背天葵的资源、栽培、化学成分、微量元素、营养与保健研究引起国内外学者的广泛注意，做了许多研究，并取得了一定的进展。但是在紫背天葵基因分子和抗逆分子方面的研究相关报道较少。因此，从分子水平对紫背天葵进行研究具有重要的现实意义^[12]。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：获得紫背天葵叶片sod酶基因的克隆。

研究内容：本实验以紫背天葵为研究对象，明确适用于紫背天葵rna的提取方法，应用基因克隆技术对sod基因全长进行测序，并对其进行生物信息学分析，再应用real-time rt-pcr等技术，对紫背天葵sod基因表达进行分析，为研究紫背天葵中sod的调控机制研究奠定基础。

拟解决的关键问题：紫背天葵叶片cu/zn-sod基因克隆。

3. 研究的方法与方案

研究方法：

1总RNA提取：改良CTAB法

1）对试验所用的金属、玻璃和塑料制品进行高温高压灭菌，烘干后备用；

2）取适量已处理冷冻叶片，加液氮于研钵中研磨成粉末，转移约0.1g粉末于已灭菌和预冷的2mL离心管中，加入1.2mL65℃预热的CTAB提取液，涡旋，充分振荡混匀；

3）振荡混匀后加入600uL氯仿/异戊醇（24:1），振荡均匀，4℃下，12000r/min，离心15min；

4）取上清液，重复步骤3）（注意加入等体积氯仿/异戊醇）；

5）取上清液，加入1/4上清体积的8mol/L Licl，混匀，-20℃下沉淀3h；

6）4℃下，12000r/min，离心15min，弃上清；

7）沉淀用500uLSSTE溶液（65℃预热）洗，使其充分溶解，加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）混匀，12000r/min，离心10min；

8）取上清液，加入1mL无水乙醇（-20℃），-20℃下沉淀3h；

9）4℃下，12000r/min，离心10min，弃上清；

10）加入1mL75%乙醇洗沉淀，8000r/min，离心10min；

11）弃酒精，干燥后，用25uLDEPC水溶解。

2总RNA反转录成cDNA

参照TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit说明书，合成第一链cDNA。RNA反转录反应体系均为10uL，具体操作如下：

1）将所需试剂放于冰上融化，混匀；

2）按以下组分配制反应液（表1）

表1

RNA反转录反应程序为：37℃ 40min，85℃5min， 4℃∞，达到4℃后可从PCR仪中取出EP管并于-20℃储藏。

3紫背天葵SOD基因克隆PCR反应

以cDNA的第一链为模板，按TaKaRa公司的Premix Taq^TM试剂盒说明书进行操作。PCR反应体系均为25 uL，具体操作如下（表2）：

表2

紫背天葵SOD基因克隆的PCR反应程序为：

95℃ 5min

94℃ 1min

60℃ 40s 30个循环

72℃ 1min

72℃ 10min

4℃ ∞

4℃下保存扩增产物并对扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，并采用以500bp的Marker作为对照（电泳操作如1.2.3），将凝胶在紫外凝胶成像仪中进行观察和拍照后，小心保存，用于后期割胶回收。

4凝胶电泳中DNA片段的回收

按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行操作：

1）在紫外灯下用干净的手术刀割下含需要回收DNA片段的琼脂块，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。放入1.5ml灭菌离心管中，计算凝胶块的重量（之前要对空离心管进行称重），该重量作为一个凝胶体积（100mg= 100uL）；

2）加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热，每2-3min间断混合，直至凝胶块完全融化；

3）加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。由于分离的DNA片段小于400bp，所以再加入1个凝胶体积的异丙醇；

4）吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2mL离心管中）12000r/min，离心1min，弃滤液；

5）将制备管置回2mL离心管，加入500uLBuffer W1，12000r/min，离心30s，弃滤液；

6）再将制备管置回2mL离心管，加入700uLBuffer W2，12000r/min，离心30s，弃滤液，以同样的方法再用700uLBuffer W2洗涤一次，12000r/min，离心1min；

7）将制备管置于2mL离心管，12000r/min，离心1min；

8）将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备膜中央加入25uLEluent（65℃预热），室温静置1min，12000r/min，离心1min洗脱DNA。

5 DNA片段与克隆载体的连接

按照TaKaRa公司的pMD19T载体试剂盒说明书进行操作，总的反应体系为10μl，具体操作如下（表3）：

表3

6大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

1）取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入2ml LB液体配培养基（不含Amp）；2）从-70℃冰箱中取出DH5α菌种，放置于冰盒中融化，用枪吸50-60μl，转入含2ml LB培养基的试管中，37℃，200rpm摇床培养过夜；

3）取0.5ml上述菌液转移到含有50ml LB培养基的三角瓶中（1%（V/V）），37℃下200rpm震荡培养2-2.5h，测定OD₆₀₀=0.4-0.6左右，此时细菌正处于对数生长期；

4）将菌液分装到20ml预冷的无菌离心管中，于冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm离心10min，以收集对数期细胞；

5）将离心管中上清液倒尽，分别加入2ml冰冷的0.1mol/L Cacl₂溶液，立即在快速混匀器上混匀，轻轻悬浮细胞，插入冰中放置30min；

6） 4℃，5000rpm离心10min，弃上清后，用1ml冰冷的含15%甘油的0.1mol/L Cacl₂溶液重悬菌体沉淀，混匀后于超净工作台中按没管100μl分装到1.5ml离心管中。可直接用作转化实验或立即放入-70℃超低温冰箱中保藏。

7 连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞

1）从-70℃冰箱中取出分装好的100μl没管的感受态细胞，放在冰浴中融化（5-6min）。完全融化后加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min；

2）移至水浴锅中42℃水浴热击90s，热击后迅速置于冰上冷却2min以上；

3）将800μl LB液体培养基（不含Amp）加入到离心管中（超净工作台酒精灯下操作），混匀后37℃震荡培养1h，转速为200rpm，使细菌恢复生长；

4）1h后，取出离心管，8000rpm，2min离心，弃上清800uLLB，将剩余约100uL菌液用灭菌的枪均匀滴在LB固体培养基上（含Amp），涂布棒置于酒精浸泡后，沥干，在酒精灯上灼烧灭菌，待其冷却后，涂布平板，使菌均匀分布，37℃下正向放置1h以吸收过多的液体；

5）37℃过夜培养，直至出现单菌落（培养基倒置）。

8 菌液PCR鉴定目的片段

1）用灭菌牙签挑取培养皿上的若干白斑，将它们分别在5ml含100μg/ml Amp抗性的LB液体培养基中37℃，200rpm恒温摇床培养12h；

2）将摇好的菌置于超净工作台上，进行菌液PCR检测。

菌液PCR反应体系（25μl），反应操作如1.2.5。

对扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。将凝胶在紫外凝胶成像仪中进行观察和摄影后，小心保存菌液。将真阳性的菌液送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。

9 序列分析

将测序结果在NCBI网站上通过Blast x进行序列的相似性分析，用Clustal X生物软件进行氨基酸序列的多序列比较分析。

技术路线：见附件。

可行性分析：

（1）实验条件：实验室具备科研条件；

（2） 实验方案及研究方法：国内外已有对紫背天葵叶片及酶基因克隆的相关研究报道，以及相关技术的应用，故实验的方案明确，研究方法成熟可靠。

结论：实验可行。

4. 研究创新点

首次对紫背天葵叶片SOD酶基因克隆。

5. 研究计划与进展

研究计划：

2015.10-11：查阅文献，确定方案

2015.12：预实验及总rna提取