选择性剪接在癌症治疗中的作用和机制外文翻译资料

选择性剪接在癌症治疗中的作用和机制

原文作者 Sophie C. Bonnal ^1,2, Irene Loacute;pez-Oreja ^1，2，3 and Juan Valcaacute;rcel^1,2,4thinsp;

单位 巴塞罗那基因组调控中心(CRG)¹，西班牙巴塞罗那庞培法布拉大学²，西班牙巴塞罗那生物特征研究所³，西班牙巴塞罗那加泰罗尼亚教育研究所(ICREA)⁴

摘要：信使RNA前体内含子的去除（前mRNA剪接）是大多数真核基因表达的必要步骤。选择性剪接使得单个基因调控产生多种mRNA和蛋白产物。癌细胞在剪接过程中具有一般的以及癌症类型特异性和亚型特异性的改变，这些改变具有预后价值，并有助于癌症进展的每个标志，包括癌症免疫反应。这些剪接变异通常与编码剪接机制核心成分或调节因子的基因中的癌症驱动因子突变有关。就治疗相关性而言，癌细胞的转录景观使它们特别容易受到剪接的药物抑制。小分子剪接调节剂目前正处于临床试验阶段，除了剪接位点转换反义寡核苷酸之外，它还为癌症治疗提供了新的个性化方法。

mRNAs是合成蛋白质的分子模板。在真核生物中，主要基因转录物，前体mRNA，通常对蛋白质合成没有功能，直到内部序列（内含子）被去除并且剩余的片段（外显子）被拼接在一起以产生成熟的mRNA（图1）。实际上，前体mRNA剪接对于gt; 95%的人基因的表达是必不可少的。该过程也可以被调节以产生编码不同蛋白质变体的交替剪接的mRNAs（图2），这是一种经常用于维持细胞稳态和调节细胞分化和发育的机制。

剪接过程及其调控与理解癌症的每一个标志（图2，补充表1）高度相关，以至于剪接改变构成了另一个癌症标志。例如，对32种癌症类型中gt; 8，000种肿瘤的分析显示，非恶性组织中不存在数千种剪接变体，这些变体可能产生癌症特异性标记物和新抗原，可潜在地用作mRNA疫苗。作为另一个例子，剪接变异体的产生通常是导致前列腺癌患者对雄激素受体靶向治疗产生耐药性以及黑色素瘤患者对维莫非尼产生耐药性的原因。此外，结果表明，癌细胞对剪接机制有特殊要求，因此它们变得特别容易受到剪接扰动的影响，这一特征正在开始被药理学利用。在本综述中，我们详细概述了剪接过程及其在癌症中的改变，然后强调了在临床肿瘤学中开发创新治疗方法的机会。

一、剪接机制与癌症

内含子的去除涉及一种化学机制，通过这种机制，RNA的多核苷酸链中的特定磷酸二酯键被切除，并形成新的磷酸二酯键。该过程分两个连续步骤进行，涉及在内含子的5rsquo;核苷酸和位于内含子3rsquo;末端上游15-30个核苷酸的关键内部腺苷残基（分支位点）之间形成不寻常的2rsquo;–5rsquo;磷酸二酯键（图1）。这种化学机制与II组自催化RNA相同，可能揭示了mRNA前内含子的祖先起源。整个II组内含子的序列塑造了精细的3D结构，使得它们能够在没有辅因子的情况下被切除，而前mRNAs中的内含子在外显子-内含子的边界只有短的共有序列，称为5rsquo;和3rsquo;剪接位点，这些内含子的去除依赖于真核细胞中最复杂的大分子复合物之一：剪接体。剪接过程是真核基因表达的一个重要步骤，毫不奇怪，遗传性癌症基因特别容易在剪接位点发生失活突变。剪接体由5个小核核糖核蛋白（snRNPs）组成（U1、U2、U4、U5和U6，其与U4紧密结合)，其中每一个都由一个特定的小核RNA （snRNA）和许多相关的蛋白质，以及gt; 150个不与snRNPs直接结合的额外多肽组成。剪接体的催化核心由独立的亚复合体重新组装在每个内含子底物上，并通过U2和U6 snRNAs之间以及snRNA和内含子剪接位点之间的RNA-RNA相互作用形成（图1）。剪接体的蛋白质组分有助于形成这种酶复合物的基于RNA的活性位点，也是其功能所必需的。

剪接体组件从U1SNRNP通过邻接的UBSNRNA的6-8个核苷酸和内含子的5rsquo;末端的邻接互连的识别5rsquo;拼接场所。U1SNRNA该区域的突变诱导5rsquo;拼接部位点利用率（表1）中可预测的变化，影响了多癌癌症患者的病人驱动基因，并赋予慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者不良预后。在音速刺猬髓母细胞瘤中，这些突变还灭活肿瘤抑制剂，例如斑驳的同源物1，以及激活原型-异丙蛋白，如Gli2和CyclinD2（REF.30）。

剪接体对3rsquo;剪接位点区域的初步鉴定涉及三种相互作用蛋白U2AF1、U2AF2和SF1识别的三个独立的序列元件（图1），它们在癌症中反复突变。U2AF1与内含子3rsquo;端的保守AG二核苷酸结合（图1）。U2AF1在髓系恶性肿瘤和肺腺癌中常发生突变（表1），但在骨髓增生异常综合征（MDS）和急性髓系白血病（AML）（如BCOR或KMT2D）中发生突变的基因的转录物中，识别前体细胞的功能保守因子的突变是如何发生的呢？这种剪接变化可能导致疾病进展；与这一概念一致，突变体U2AF1导致自噬相关因子7 （Atg7）前mRNA的异常加工。令人惊讶的是，其与远端切割和聚腺苷酸化位点的选择有关（图3a）和有利于小鼠前B细胞转化的自噬缺陷。然而，考虑到人与小鼠之间选择性剪接事件的保守性有限，在小鼠模型中观察到的剪接改变的影响可能与在人肿瘤中观察到的不同。事实上，与驱动突变的预期相反，小鼠模型已经显示，与剪接因子-野生型细胞相比，剪接因子-突变细胞具有受损的竞争性再群体能力。最后，在携带常见U2AF1S34F突变的人细胞系中，U2AF1通过直接结合近起始密码子在翻译抑制中的非典型作用被改变，导致分泌的趋化因子IL-8表达增加，进而可导致炎症和肿瘤进展。

剪接体组装的下一步涉及U2 snRNP在分支位点周围的ATP依赖性稳定结合（图1）。与U1 snRNA识别5rsquo;剪接位点的情况一样，U2 snRNP识别分支位点涉及碱基配对相互作用，这一次是在U2 snRNA的6个核苷酸和mRNA前内含子中分支位点腺苷侧翼的核苷酸之间。SF3B1是U2 snRNP的关键蛋白组分，可识别分支位点和U2 snRNA-mRNA前体螺旋，并通过mRNA前体结合诱导的构象变化，促进分支位点腺苷接近5rsquo;剪接位点和剪接反应的第一步（详见下文）。SF3B1突变是各种癌症中最常见的突变之一，其患病率从乳腺癌的5%到一类具有环铁粒幼细胞的MDS病的81%不等（表1）。例如，在约10%的CLL病患者中检测到SF3B1突变，K700E突变是在该病任何基因中观察到的最频繁的单个氨基酸变化之一，并且与疾病快速进展和不利的总体生存率相关。

如上文针对U2AF1所讨论的，值得注意的是，剪接装置的关键核心成分中的突变有助于癌症的进展，而不是在内含子去除中引起可能危及细胞存活的一般缺陷。影响SF3B1的突变破坏该蛋白与剪接因子SUGP1的相互作用，并导致使用通常在野生型细胞中使用的3rsquo;剪接位点上游30个核苷酸窗口内的隐性3rsquo;剪接位点（图3B）。这些变化可能通过影响特定基因的表达或功能而导致癌症进展。例如，各种SF3B1突变导致使用一个隐蔽的3rsquo;剪接位点，并在BRD9转录物中包含一个相关的隐蔽外显子，这将过早终止密码子引入BRD9开放阅读框，从而通过无意义介导的衰变过程导致mRNA降解。反过来，这一过程导致BRD9蛋白水平降低，BRD 9蛋白是非典型染色质重塑复合体BAF的核心成分，也是一种强效肿瘤抑制剂，从而促进葡萄膜黑色素瘤的发生。

由SF3B1突变诱导的替代3rsquo;剪接位点的使用也可能是个性化疫苗或采用基于T细胞的治疗的新抗原来源。令人惊讶的是，在SF3B1突变的MDS54的骨髓样本中检测到的最常见剪接改变似乎是低水平但广泛的内含子保留亚型减少（即受调控内含子的剪接增强）。值得注意的是，SF3B1是动物模型中具有抗肿瘤活性的几种天然和合成化合物家族的靶点（见下文）。U1和U2 snRNPs对剪接位点的识别受许多其他因素的辅助和调节，其中一些因素已成为剪接调节因子的典型例子，包括各种RNA结合蛋白家族的成员，如富含精氨酸-丝氨酸（SR）、异质性核核糖核蛋白（hnRNP）和RNA结合基序（RBM）蛋白。这些因子识别位于内含子或外显子中的特定调节序列，并以位置依赖性方式促进或抑制核心剪接机制对相邻剪接位点的识别（图2a）。改变剪接调节序列的同义突变通常通过诱导原癌基因或肿瘤抑制基因编码的前mRNAs的选择性剪接发生变化，导致功能不同的蛋白质同工型或移码和无意义介导的衰变，从而成为癌症的驱动突变。这种调节的一个经典例子是由SRSF2提供的，它是一种SR蛋白，与特异性外显子剪接增强子结合，并刺激U1或U2 snRNPs识别侧翼剪接位点（图2a）。SRSF2在多种髓系肿瘤中频繁发生突变（表2），包括慢性粒单核细胞白血病（CMML）；这些突变中的至少一种改变了SRSF2对前mRNAs中不同结合位点的相对亲和力，从而改变了被激活的外显子剪接增强子的一致性，进而导致外显子包含的错配（图3c），并最终导致贫血、白细胞减少和形态发育不良。SF3B1或SRSF2突变也已显示可产生激活核因子-kappa;B信号传导的亚型，例如MAPKKK7或凋亡蛋白酶 8。RBM10提供了另一个实例，其促进编码等级调节剂数量的前体mRNA中外显子9的跳跃，导致抗增殖同工型的表达增加（图4）。编码RBM10的基因在许多实体瘤（包括肺腺癌）中经常发生突变，并且至少有一种突变形式未能调节数量的剪接，可能是通过影响其与其他剪接体成分的相互作用（该突变体不具有改变的RNA结合特性），从而增加促增殖同工型的表达。

除了主要的剪接体途径之外，一个内含子子集带有剪接位点序列的独特构型，被次要的剪接体切除。这种机制包括U11和U12 snRNPs，它们在识别5rsquo;和3rsquo;剪接位点方面的作用分别与U1和U2 snRNPs相当。ZRSR2是U11–U12二snRNP复合体的一个组成部分，具有类似于U2AF1的结构域组织，并且与U2AF1本身一样，参与3rsquo;剪接位点识别。ZRSR2突变在MDS很常见。突变分布在整个基因中，表明ZRSR2功能的丧失会导致MDS病，这与U2AF1、SF3B1或SRSF2中的突变频繁聚集在这些蛋白的特定结构域甚至残基内形成对比。ZRSR2突变的存在与U12型内含子保留的整体增加有关（图3d），其中一些位于在细胞周期控制中具有重要功能的基因内。

相关的是，U2AF1、SF3B1和ZRSR2在3rsquo;剪接位点识别中具有直接作用，并且SRSF2还可以通过与外显子增强子的关联来促进这种识别。鉴于所有这些蛋白在功能上都与U2 snRNP（或在ZRSR2的情况下，其在小剪接体中的等价物）连接，编码这些因子的基因中的突变以互斥的方式发生（少数MDS病患者中的SF3B1和SRSF2突变除外）。这一发现表明，突变作用于一个共同的途径，因此，一旦该途径被一个突变改变，其他突变就变得多余，并且在肿瘤中没有被积极选择。另一个显著特征是突变为杂合，表明癌细胞存活至少需要一个功能等位基因。总之，这些观察结果表明，在癌细胞中建立了有利于肿瘤生长的剪接变异体的产生与保留细胞功能通常所需的基本基因表达过程之间的微妙平衡。如本综述后续章节所述，这些考虑因素可能对基于剪接的癌症治疗设计具有重要意义。然而，我们强调剪接因子突变可能致癌效应背后的机制仍有待严格证明。一个悬而未决的问题是，这些效应是否依赖于一个或几个关键靶基因剪接的改变，或者它们是否反映了剪接中相对大量改变的集体效应，或者甚至是否存在与剪接没有直接关系的其他机制解释。例如，有人提出R环（转录过程中产生的RNA-DNA杂交体）的扩增形成是MDS剪接因子突变致癌作用的统一机制。这种现象会导致ATR途径的复制应激和激活，表明ATR抑制剂可以为剪接因子突变的MDS病提供治疗机会。

在U1和U2 snRNPs对剪接位点进行初步识别后，snRNP U4–U6–U5与复合体结合，引发显著的构象变化和蛋白质交换，从而形成剪接体的催化核心，从而完成剪接反应。影响剪接体形成晚期和催化活化相关因素的突变也与癌症相关，包括PRPF8，这是进化上最保守的剪接体成分，参与以RNA为基础的催化核心的伴侣作用。髓系肿瘤中检测到的PRPF8突变与导致错误剪接的缺陷相关，酵母中的等效突变会导致第二催化步骤中剪接校对的缺陷。这些观察结果与多项研究的结果一致，这些研究表明，发生在剪接体组装和催化后期的复杂催化核心构象动力学也可能是剪接调控的目标，从而导致致癌转化。

癌症中剪接因子表达的改变。对33种癌症类型的癌症基因组图谱数据的分析表明，119个编码核心剪接因子和调节因子的基因（约为该机制组成部分的60%）中发生了推定的癌症驱动因子突变。除突变外，剪接因子表达水平的变化（通常与基因组重排相关）也与肿瘤发生或肿瘤抑制丧失相关:已发现癌症中84%的RNA结合蛋白和gt; 70%的剪接因子在mRNA表达水平上失调。蛋白质组分析也表明CLL存在剪接体失调的亚类型独立特征。此外，SR蛋白SRSF1的表达在各种实体瘤中经常上调，包括乳腺癌和肺癌；SRSF1是MYC的直接靶点，其表达升高与肿瘤分级升高、生存率降低和化疗耐药性相关。这些特征与控制细胞生长、凋亡或运动的基因的选择性剪接改变有关。值得注意的是，在体外和小鼠异种移植模型中，使用含有SRSF1结合位点的诱饵寡核苷酸滴定SRSF1活性会导致癌细胞生长和凋亡受到抑制。

导致转录因子与剪接调节蛋白EWS和RBM15融合的染色体重排分别是尤文肉瘤和儿科急性巨核细胞白血病的特征。由于这些蛋白的RNA结合功能，这些遗传性病变还可改变多种癌症相关基因（包括编码RNA-DNA解旋酶DHX9和ARID1A的基因）的前体mRNA的选择性剪接，具有致癌作用。最后，已检测到癌症样本中snRNA表达的显著差异，在浸润性乳腺导管癌患者队列中，发现受乳腺癌细胞系中snRNA水平影响的基因优先错剪接，这表明snRNA水平的变化也可能导致癌症进展。

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