DNA甲基转移酶在表型退化绿僵菌连续植物传代中对分生孢子的恢复作用外文翻译资料

英语原文共 13 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

DNA甲基转移酶在表型退化绿僵菌连续植物传代中对分生孢子的恢复作用

摘要：罗伯茨绿僵菌是一种有两种生活方式的真菌；它是一种植物根系共生体和一种昆虫病原体。自发的M.robertsii菌株ARSEF 2575（M.robertsii lc-2575；lc=低分生孢子）的表型退化菌株显示在琼脂培养基上连续传代后，分生孢子和真菌毒力降低。为了恢复分生孢子，我们通过植物（菜豆和柳枝稷）根或昆虫（麦氏凯丹菌）实验传代M.robertsii lc-2575幼虫。经过五代传代后，结果菌株在琼脂上显著增加了分生孢子产量，并在培养基上增加了毒力昆虫生物测定。同时，DNA甲基转移酶、MrDIM-2在BR5（一种5年后的菌株）中的表达下调根通道），并在柳枝稷和昆虫通道后分离。亚硫酸氢盐测序显示总体基因组差异不大，罗伯茨支原体lc-2575和BR5之间的DNA甲基化水平（~0.37%）。然而，对不同的甲基化区（DMR）显示BR5的DMR在基因间区（69.32%）比在基因间区更丰富罗伯茨支原体lc-2575（33.33%）。向琼脂中添加DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂胞苷支持该作用导致罗伯茨支原体lc-2575分生孢子数增加。基因表达差异显著与M.robertsii lc-2575相比，在BR5的选定DMR中观察到。在这里，我们将表观遗传调控与通过DNA甲基转移酶的作用恢复分生孢子，这种植物传代可以作为一种恢复分生孢子的方法表型退化的罗伯茨支原体的真菌分生孢子和毒力。

关键词：罗伯茨绿僵菌；分生孢子生产；植物通道；DNA甲基转移酶；毒性；根系定殖

引 言

罗伯茨绿僵菌是一种子囊真菌（Bischoff等人，2009年）生活方式多样；它是一种可以在植物根平面和在皮层根细胞之间或内部内生生长（Sasan和Bidochka，2012年）的昆虫病原真菌；它也是一种腐生物。这是一个是研究得最好的昆虫病原真菌之一，并已被使用作为一种生物杀虫剂来对付各种节肢动物（方等人，2012年）。内生能力和昆虫致病性是耦合的，因为来自受感染昆虫的昆虫源氮通过真菌菌丝体转移到宿主植物（Behie et al.2012；Behie and Bidochka 2014）。同时，这种植物可以为真菌提供光合产物（Behie et al.2017）。这种共生关系对植物有益（Hu和Bidochka 2019）；它促进植物生长并对抗植物病原体（Sasan和Bidochka 2013）。

罗伯茨支原体不是一种专性病原体，很容易在各种人工培养基上培养，并在那里产生细菌分生孢子。然而，在琼脂培养基上重复传代培养期间，一些M.robertsii菌株自发产生的分生孢子较少，真菌毒力下降，并以蓬松的菌丝表型生长，这种现象称为表型退化（Ryan et al.2002）。自发表型退化不仅限于绿僵菌，而且在丝状真菌在人工琼脂培养基上连续繁殖后观察到，据报道这是衰老的迹象（Wang等人2005年；Li等人2014年）。从T-DNA插入文库中，参与转运体、转录调节和RNA或能量代谢的基因的破坏也会导致罗伯茨支原体的菌落分裂（Zeng等人，2017年）。然而，用于昆虫生物防治的绿僵菌的商业生产需要优化分生孢子的生产。分生孢子起着重要的作用在发病机制中起重要作用，因为它是感染繁殖体，因此在疾病传播中不可或缺，并且是商用真菌杀虫剂的活性成分。分生孢子在昆虫角质层表面萌发，然后穿透角质层，通过机械力和水解酶进入营养丰富的血腔。昆虫死亡是由于整个昆虫血腔中真菌生长的分支（Small and Bidochka 2005）。此后，尸体被制成木乃伊，带有分生菌丝。M.robertsii也被用作植物生长促进剂（Behie等人，2017年）。因此，分生孢子的损失或减少是罗伯茨支原体成功应用于害虫防治和/或作为植物生物肥料的障碍。

DNA甲基化与罗伯茨支原体有关，两个DNMTase基因MrDIM-2和MrRID在菌丝体中的表达存在显著差异和分生孢子（Li等人，2017年）。在真菌发育过程中DNA甲基化的参与在其他真菌中也有报道。在昆虫病原真菌蛹虫草中，DNA甲基化参与真菌发育过程中的全局重编程（Wang等人，2015）。在稻瘟病的病原菌稻瘟病菌中，发现分生孢子和附着胞的DNA中甲基化结构域的出现程度相对较菌丝体为低（Jeon等人，2015）。在米曲霉DNA甲基转移酶基因缺失的突变体中观察到菌落形态、放射状生长和孢子形成异常（Jeon等人，2015年）。

在这里，我们通过连续传代植物（兵豆和柳枝稷）或真菌，恢复了昆虫（蜡蛾）寄主中表型退化的罗伯茨支原体的分生孢子产生和真菌毒力。在表型退化菌株通过植物或昆虫宿主恢复分生孢子生产的过程中，观察到DNMTase的表达减少。我们还观察了一种蛋白激酶的转录表达以及参与分生孢子和代谢的功能基因的变化。尽管我们通过亚硫酸氢盐测序观察到两个菌株之间的基因组甲基化总体水平（恶化与恢复）没有差异，但更精细的基因组分析显示，两个菌株基因间区域中不同甲基化区域（DMR）的分布存在差异。

材料和方法

2.1 真菌培养

M.robertsii lc-2575（lc=低分生孢子；Mr lc-2575）为在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA；Difco Laboratories，BD，Missisauga，on，Canada）上连续传代后，从表达绿色荧光蛋白（GFP）的M.robertsii ARSEF 2575 GFP的自发菌丝体部分分离。表达GFP的质粒的构建以及M.robertsii ARSEF 2575的转化之前已有描述（Fang et al.2006）。lc-2575也表达了GFP。Mr lc-2575表现出表型退化：在27°C的PDA上生长时，分生孢子数量减少，菌丝生长蓬松。分生孢子从含有0.01%Triton X的12天龄PDA培养物中去除，悬浮液通过含有玻璃棉的漏斗，以获得分生孢子悬浮液。使用血液细胞仪将悬浮液的浓度调整为106分生孢子/mL数数。

2.2 植物传代和根系定植

菜豆和圆锥花序的种子（柳枝稷）是从OSC种子中获得的，加拿大安大略省滑铁卢。为了防止真菌或细菌污染，种子进行了表面消毒。种子在无菌蒸馏水中浸泡15分钟，然后在4%次氯酸钠溶液中浸泡三次，持续5分钟。每次，倾析液体，并用无菌蒸馏水冲洗种子。无菌处理过的种子在4°C下保存过夜，以便同步生长，然后放置在无菌潮湿滤纸上，滤纸放置在培养皿中，在25°C下光周期为16小时。根据需要添加无菌水，以保持滤纸湿润。通过将灭菌种子镀到PDA上，检测其是否受到真菌或细菌污染。士兵豆种子在3天和柳枝稷种子5天内形成可见根。

土壤（Schultz Potting Mixel，布兰特福德，加拿大安大略省）为在121°C下高压灭菌20分钟，三次每隔24小时。植物被种植在花园的塑料盆里（高10厘米，直径15厘米）。花园花盆在使用前用紫外线消毒3小时。这些罐子装满无菌土壤，距顶部1厘米，并用无菌蒸馏水湿润。每盆种植一个无菌发芽的菜豆种子或十个无菌发芽的柳枝稷种子。采用改良的土壤浸水法将分生孢子接种到土壤中（Greenfield et al.2016）。将5毫升106分生孢子/mL Mr lc-2575悬浮液用移液管移到幼苗周围的土壤表面。然后在白天25°C和夜间18°C的条件下，在湿度为70%的条件下，每天16小时的光照周期。每天用无菌蒸馏水给植物浇水。

这些植物在放置在容器中10天后收获并彻底清洗土壤，直到清除所有剩余土壤。然后在0.01%Triton X中使用旋转式均质机（德国弗里肯豪森Greiner Scientific）均质植物根系。旋涡后，然后将400mu;L该匀浆涂抹在选择性YPD琼脂培养基（2 g/L酵母提取物、10 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、15 g/L琼脂、0.5 g/L放线菌酮、0.2 g/L氯霉素、0.5 g/L 65%多丁和0.01 g/L结晶紫）（Behie和Bidochka 2014）上，并在27°C下培养12天，共复制四次。

从选择性培养基中随机分离出一个菌落琼脂平板，转移到PDA平板上收集分生孢子为了在一代又一代的植物中定居。这个每个菌株的分生孢子在10%甘油中储存minus;80°C。Mr lc-2575通过士兵豆子和柳枝稷经过5代传代。

2.3 昆虫通道

对于昆虫传代，分生孢子被局部应用于蜡蛾幼虫（Galleria mellonella）（Missisauga进口，霍尔顿，加拿大安大略省）。用5mu;Ltimes;106分生孢子/mL Mr lc-2575将单个幼虫（N=20）接种在背表面，并分别放入带有湿无菌滤纸的60mmtimes;15mm皮氏培养皿（加拿大多伦多费希尔科学公司）中，以保持高湿度，并在27°C的黑暗中孵化。从5天后死亡的第一个感染昆虫中采集分生孢子，随后在尸体上显示分生孢子。使用无菌环除去昆虫尸体上的分生孢子，然后在PDA上划线。从PDA平板上，随机选择一个菌落继续进行下一代，类似于植物传代，产生五代昆虫传代。

2.4 分生孢子产生

对每次传代后真菌菌株的分生孢子产量进行了评估（Kamp和Bidochka 2002）。从先前生长的12天PDA平板（10厘米皮氏培养皿，含10毫升马铃薯葡萄糖琼脂培养基）中分离的单菌落菌株，用5mu;L分生孢子悬浮液（106个分生孢子/mL 0.01%Triton X溶液）点接种到PDA平板的中心。对于DNA甲基转移酶抑制实验，我们在用1、2、5和10 mM 5-氮杂胞苷（美国密苏里州圣路易斯西格玛·奥尔德里奇公司）修饰的PDA平板上培养了Mr lc-2575。在27°C下12天后评估分生孢子的产生。为了量化分生孢子的产生，在第12天在皮氏培养皿中心到菌落周长的中间取一个直径为7 mm的塞子。将塞子浸入0.7 mL 0.01%Triton X-100中，旋转约1分钟。然后使用血液细胞仪对分生孢子进行计数。每个样本计数三个重复。

测试压力条件是否触发了大脑的恢复分生孢子，Mrlc-2575在PDA上生长，PDA用0.5毫米刚果红进行细胞壁应力修正，0.5毫米NaCl进行细胞壁应力修正高渗应激（Moonjely et al.2018）和1/2 PDA（12 g/L土豆葡萄糖肉汤，15 g/L琼脂）用于低营养水平，在27°C下放置12天后检测菌落形态。

2.5 生物测定

如前所述（Moonjely和Bidochka 2019），对来自植物和昆虫通道的菌株对蜡螟（G.mellonella）幼虫的真菌毒力进行了检测。将兵豆、柳枝稷和昆虫的第1、3和5代的5mu;L分生孢子悬浮液（106分生孢子/mL 0.01%Triton X溶液）局部涂抹在蜡蛾幼虫的表皮上。因此，对每个传代的3株菌株、Mr lc-2575和未接种的对照（0.01%Triton X溶液）进行了检测。每只幼虫分别置于60mmtimes;15mm的培养皿中。用一张湿润的滤纸在每个皮氏培养皿中保持湿度。将处理过的昆虫置于25°C下，在10天内每天记录死亡率。每个重复包含20个幼虫，分5个重复进行。实验重复了两次。采用概率分析（Finney 1971）计算平均致死时间（LT50）值。

2.6 DNMTase活性的抑制

Mr lc-2575和BR5（5代后的合成菌株）豆根通道）在用1 mM 5-氮杂胞苷（5AZ）修饰的PDA平板上培养（Lin等人2013），并在27°C下培养。在第12天评估分生孢子产量。同时，在第12天收获真菌生物量，并通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测功能基因的表达。每个试验分别进行三次重复。

2.7 亚硫酸氢盐测序文库的构建以及高通量测序

我们比较了Mr lc-2575和BR5中的基因组甲基化使用亚硫酸氢盐测序。这里，使用Covaris M220聚焦超声仪将基因组DNA随机剪切至200–400 bptrade; （Covaris Inc.，美国马萨诸塞州沃伯恩），然后进行末端修复，添加一条尾巴，并连接测序连接子，根据制造商的说明，所有胞嘧啶在测序连接子中甲基化（Illumina Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥）。亚硫酸氢盐处理使用ZYMO EZ DNA甲基化金试剂盒（美国加利福尼亚州奥兰治ZYMO Research）进行。进行PCR扩增以获得最终的全基因组亚硫酸氢盐测序文库。在制备文库后，分别使用Quabit 2.0荧光计（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德Life Technologies公司）和安捷伦2100生物分析仪（美国加利福尼亚州帕洛阿尔托安捷伦科技公司）检测文库的浓度和插入大小，并通过定量PCR定量测定文库的有效浓度（gt;2nm），以确保文库质量。结果DNA由Illumina HiSeq，PE150（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国）根据制造商的说明进行配对末端测序。

2.8 BS Seq读取的初始处理和映射

在绘制图谱之前，对Illumina测序的短片段进行筛选。使用Trim软件移除测序适配器和测序数据的低质量数据，获得的干净数据用于后续分析。所有干净的亚硫酸氢盐测序（BS-Seq）读数均通过BSMAP比对器（全基因组亚硫酸氢盐序列作图程序）映射到参考基因组M.robertsii菌株ARSEF 2575（Xi和Li 2009）。

2.9 BS-Seq数据的生物信息学分析

根据之前报道的方法（Li等人，2017年），差异甲基化区（DMR）被鉴定。利用C-位点甲基化水平结果文件，使用滑动窗口方法，以50 bp的间隔滑动200 bp的窗口，将Mr lc-2575中的DNA甲基化水平与BR5中的甲基化水平进行比较。对滑动窗口中所有C位点的甲基化水平差异进行统计分析（t检验）。最后，通过筛选得到DMR。（P值lt;0.01，样本间差异水平（diff）gt;0.005）。

2.10 甲基化水平检测的可靠性评估

在分析之前，通过检测文库中检测到的线粒体

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[591060]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word