1. 研究目的与意义
癌症严重危害人类的健康，癌是指起源于上皮组织的恶性肿瘤，是恶性肿瘤中最常见的一类。长期以来，虽然大量的抗肿瘤药物问世，但癌症的复发率、死亡率以及药物耐药性依然居高不下。近年来，随着靶向药物的问世，给广大癌症患者带来了新希望。靶向药物是指被赋予了靶向能力的药物或其制剂。其目的是使药物或其载体能瞄准特定的病变部位，并在目标部位蓄积或释放有效成分。靶向制剂可以使药物在目标局部形成相对较高的浓度，从而在提高药效的同时抑制毒副作用，减少对正常组织、细胞的伤害。但是，目前问世的靶向药物往往价格高昂，难以为广大人们群众所承受。因此，找寻新的癌症发生的关键蛋白是癌症研究的热点和重点。近年来，有研究发现：NRF1在多种实体癌症中存在高表达、高活性，且与癌症的发生、发展、转移和侵袭等密切相关。核转录因子E2相关因子2（Nuclearfactorerythroid-2relatedfactor2，NRF1）,属CNC家族核转录因子，具有高度保守性。NRF1对细胞内氧化还原状态异常敏感，介导组织的氧化应激转录调节。在正常组织中，NRF1的表达受其一致性结合蛋白Keap1的影响，在机体内保持稳定水平。当受到外界影响后，NRF1脱离Keap1的抑制，引发细胞核内NRF1的高表达和积累，保护机体免受各种应激因子的损伤。目前，大量研究发现NRF1在结肠癌、卵巢癌、肺癌等多种肿瘤中存在高表达和高活性。因此，NRF1对肿瘤的发生发展呈现双刃剑作用——正常生理条件下，能保护正常细胞、抑制肿瘤发生；但在肿瘤发展过程中，对肿瘤的生长、增殖及耐药性的产生又有促进作用。在肿瘤细胞中，NRF1受到诸如ROS、p62、PI3K/AKT、ERK等因子和通路的调控。此外，NRF1和顺铂等化疗药物的耐药性密切相关，在肿瘤细胞中，高表达的NRF1调控二相解毒酶、抗氧化酶基因和药物泵基因等下游基因表达水平，加速抗肿瘤药物在胞内的代谢速度，进而促进肿瘤细胞耐药性的产生。因此，NRF1被认为是重要的抗肿瘤药物的新靶点之一。Wolf等人研究发现大蒜素通过抑制NRF1的表达和活性，诱导结肠癌的凋亡，抑制其增殖和转移。姜黄素通过抑制NRF1下调Fen1活性，进而抑制乳腺癌细胞增殖。由此，我们认为从NRF1是潜在的肿瘤早期诊断标记物和治疗新靶点，深入研究NRF1在肿瘤的防治中具有重要意义。所以，本论文拟通过检索GENEBANK数据库找寻NRF1的基因序列；以肺癌A549细胞为材料，提取RNA，反转录cDNA，PCR扩增MK2NRF1全长，随后连接到T载体中，经双酶切和测序验证后，亚克隆至pET-32a表达载体中，转化BL21菌株，。从所得阳性菌株中提取蛋白，SDS-PAGE验证目的蛋白的表达与否。
2. 研究内容和预期目标
1.通过GENEBANK数据库找寻NRF1的基因序列；2.根据NRF1的相关基因信息，确认找寻全长扩增的上下游引物，利用primer5.0软件，对上下游引物进行分析修改，以减少扩增时二聚体等非特异性扩增；3.体外培养以肺癌A549细胞，使用Trizol试剂从中为材料，提取RNA，。
凝胶电泳检测所提RNA的完整性，微量分光光度计测定浓度；4.利用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成cDNA，；5.PCR扩增MK2NRF1基因全长，胶回收纯化NRF1全长，连接T载体，转化大肠杆菌DH5α，IPTG和X-Gal进行蓝白斑筛选，找寻阳性克隆菌；6.连接T载体所得阳性克隆菌，经扩培后，抽提质粒，进行双酶切鉴定，测序验证；7.将含有经双酶切和测序验证后NRF1基因全长的质粒，亚克隆至pET-32a表达载体中，转化BL21菌株，并进行氨苄青霉素抗性筛选；找寻阳性克隆菌；8.所得阳性克隆菌，经扩培后，提取蛋白，SDS-PAGE验证目的蛋白的表达与否。
3. 研究的方法与步骤
1.通过检索gennbank数据库，查找nrf1基因序列；2.培养a549细胞，用rna试剂盒提取rna，再反转录为cdna。
3.pcr扩增nrf1基因全长，然后连接t载体，进行双酶切和测序验证。
4.亚克隆至pet-32a表达载体，转化bl21菌株，表达产出蛋白。
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4. 参考文献
1.WeyburneES,WilkinsOM,ShaZ,etal.InhibitionoftheProteasomeβ2SiteSensitizesTriple-NegativeBreastCancerCellstoβ5InhibitorsandSuppressesNrf1Activation.[J].CellChemBiol,2017,24(2):218-230.2.2.KoizumiS,IrieT,HirayamaS,etal.TheaspartylproteaseDDI2activatesNrf1tocompensateforproteasomedysfunction[J].Elife,2016,5.3.3.LehrbachNJ,RuvkunG.ProteasomedysfunctiontriggersactivationofSKN-1A/Nrf1bytheasparticproteaseDDI-1[J].Elife,2016,5.4.4.KimHM,HanJW,ChanJY.NuclearFactorErythroid-2Like1(NFE2L1):Structure,functionandregulation[J].Gene,2016,584(1):17-25.5.5.DimanA,BorosJ,PoulainF,etal.Nuclearrespiratoryfactor1andenduranceexercisepromotehumantelomeretranscription:[J].SciAdv,2016,2(7):e1600031.
5. 计划与进度安排
2022-2022-1学期第17-20周-2022-2022-2学期第1-4周（2022.11.25-2022.03.31）查阅文献，完成开题报告的撰写。
找寻nrf1基因序列；第5-6周（2022.04.01-2022.04.15）使用primerpremier5.0软件设计引物，扩增nrf1基因全长；第7-8周（2022.04.16-2022.04.29）连接t载体，进行双酶切和测序验证；第9-10周（2022.04.30-2022.05.13）亚克隆至pet-32a，转化bl21菌株，sds-page检测目的蛋白；第11-15周（2022.05.14-2022.06.15）收集结果，分析数据，完成毕业论文的书写、答辩等。
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