1. 研究目的与意义
研究背景：大曲是大曲酒生产的糖化剂和发酵剂,含有多种微生物及其产生的多种酶类,它构成了酿酒过程的内在动力。由于大曲的生产是传统工艺,依靠自然培菌来网罗和富集环境中的微生物。因此,大曲中的微生物组成十分复杂。多年来,人们致力于增强对大曲中微生物多样性的认识,但由于受技术以及研究手段的限制,基本上是以传统的形态和生理生化特征来进行分类和鉴定。浓香型白酒是我国大曲酒中的一朵奇葩，在白酒消费市场上占据着主导的位置。“曲为酒之骨”，大曲是固态白酒酿造产酒和生香的发酵剂，是传统白酒生产的基础，对白酒的质量有着十分重要的影响。因此，中高温大曲作为影响浓香型白酒品质的一个重要因素，其品质需引起高度重视。中温大曲是一种以小麦为主要原料制成的多菌多酶体系，主要作为浓香型白酒生产的发酵剂。其中包含种类丰富的霉菌、酵母菌和细菌。
目的及意义：霉菌具有较强的糖化酶和蛋白酶酶系，能把原料中的淀粉、蛋白等大分子降解成其他微生物能利用的小分子物质，供其它微生物利用。筛选具有较强糖化力和液化力的霉菌菌株对发掘大曲微生物资源以及后续人工强化制曲有重要的意义。2. 研究内容和预期目标
| 任务内容： 1、中温大曲中霉菌的分离； 2、筛选菌株的酶学性质研究； 3、筛选菌株的培养条件研究； 4、筛选菌株的鉴定。 预期目标： 分离出霉菌，对霉菌进行斜面保存，对其酶学性质进行测定，研究霉菌的最佳培养条件，鉴定霉菌种类，研究其生理特征。 |
3. 研究的方法与步骤
| 1、中温大曲中霉菌的分离： 配置PDA培养基，对大曲进行梯度稀释，将不同稀释倍数，如10-3、10-4、10-5、10-6的大曲稀释液涂布在PDA培养基上，进行28℃恒温培养。长出菌落后用划线法进行分离纯化，获得单菌落霉菌。 2、筛选菌株的酶学性质研究： 将霉菌在液体PDA培养基进行液体培养，摇床150rpm，28℃培养3-5天，同步测量生长速率。培养3-5天后取发酵液用生物传感分析仪测量霉菌的酶学性质：糖化力、液化力、酯化力。 3、筛选菌株的培养条件研究: (1)、对酸度进行研究：配置不同pH梯度，如Ph3、pH4.5、pH6的PDA培养基，将霉圆片接在培养基上，在同一温度28℃进行培养观察。 （2）、对温度进行研究：用同样的PDA培养基，分别放置在不同温度，如33℃、53℃、63℃的培养箱进行培养观察。 （3）、对乙醇浓度进行研究：配置不同乙醇浓度，如0、2%、4%、6%、8%、10%的PDA培养基，将霉圆片接在培养基上，在同一温度28℃进行培养观察。 4、筛选菌株的鉴定： 在形态和分子两个方面进行鉴定。形态方面：拍照，制作切片，电镜进行观察分析。 分子方面：进行DNA测序，获得分子序列，画出进化树，结合形态学确定菌种。 |
4. 参考文献
| [1] 班世栋, 王晓丹, 陈孟强, 等. 酱香型大曲中具产酶功能霉菌的分离筛选[J]. 酿酒, 2014 (4): 31-36. [2] 张霞, 武志芳, 张胜潮, 等. 贵州浓香型白酒大曲中霉菌的 18SrDNA 系统发育分析 [J]. 应用与环境生物学报,2011, 17(3): 334-337. [3] 黄丹, 储玉龙, 尚志超, 等. 大曲酯化酶根霉菌的分离及产酶条件研究[J]. 食品与发酵科技, 2010, 46(3): 30-32. [4] 刘文英, 解谦, 刘建霞, 等. 山西边城酒大曲中优势霉菌的分离和形态鉴定[J]. 农业与技术, 2013, 33(7): 8-9. [5] 王旭亮, 王异静, 王德良, 等. 白酒发酵高糖化性能霉菌的筛选及鉴定[J]. 酿酒科技, 2012, 9: 22-28. [6] 成剑峰, 郭文娟, 胡红娟. 大曲中耐酸性霉菌的分离及其糖化特性研究[J]. 酿酒科技, 2013, 7: 005. [7] 夏艳秋, 朱强, 汪志君. 高产糖化酶黄曲霉菌的选育及初步应用[J]. 微生物学通报, 2009, 36(10): 1542-1546. [8] 吴荣荣, 张志民, 张煜行, 等. 黑曲霉 M2 固态发酵产液化酶和糖化酶的研究[J]. 中国酿造, 2012, 31(1): 107-110. [9] 陈之瑶, 冯云子, 尹文颖, 等. 不同菌种制备酱油大曲生产酶系特性及其耐盐性的比较[J]. 食品与发酵工业, 2012, 38(6): 7-11. [11] Shafique S,Bajwa R, Shafique S. Screening of Aspergillus niger and A. flavus strains forextra cellular alpha-amylase activity[J]. Pak. J. Bot, 2009, 41(2): 897-905. |
5. 计划与进度安排
| 1、2022年12月24日—2022年4月9日 接受任务，查阅和翻译文献，完成开题报告； 2、2022年4月10日—2022年4月25日 中温大曲中霉菌的分离； 3、2022年4月26日—2022年5月5日 筛选菌株的酶学性质研究； 4、2022年5月6日—2022年5月25日 筛选菌株的培养条件研究； 5、2022年5月26日—2022年6月5日 筛选菌株的鉴定； 6、2022年6月6日—2022年6月17日 撰写论文，毕业答辩。 |
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