1. 研究目的与意义
纤维素是地球上最丰富,最廉价的可再生资源。资料表明,植物通过光合作用是光能以生物能行驶固定下来,其生成量每年高达 ,这些能量相当于目前为止世界能消耗总量的10倍,其这些生物能年复一年通过自然界物质循环生成,是不会枯竭的可再生资源。这些生物量种有大部分是以纤维素,半纤维素形式存在,因此研究开发纤维素转化技术,姜秸秆,蔗渣,废纸,垃圾纤维素类物质高效转化为糖,进一步发酵成酒精,对开发新能源,保护环境,具有非常重要的现实意义。
已经证实,添加表面活性剂,如非离子去污剂和蛋白能有效哦提高纤维素向可溶性糖的转化水平。最近,对蒸汽处理过的软木物质的研究表明,飞例子去污剂促进作用的主要机理依赖于纤维素表面活性剂和木质素表面相互作用的影响。木质素对表面活性剂的吸附可以阻止酶与木质素的无效结合。因此,可以得到高产量和易回收的酶,这与在表面活性剂的情况下,木质纤维素与少量的酶吸附的结果是一致的。补加蛋白如bsa也被认为是和木质素结合,阻止与纤维素酶的无效结合。
其他的机理包括表面活性剂可以改变底物的特性,增加了纤维素可供吸附的表面,一次刺激反应位点而吸附到酶上。表面活性剂对酶也有稳定效应,在水解过程中有效地阻止了酶的变性。这可能是表面活性剂与酶蛋白的三级结构发生键合,由其他酶类似情况可得。
2. 国内外研究现状分析
天然纤维素酶解过程可分 3 个阶段. 首先是纤维素对纤维素酶的可接触性;其次是纤维素酶的被吸附与扩散过程;最后是由CBH-CMCase和βGase自组织复合体(C1)协同作用降解纤维素的结晶区,同时由CBH-CMCase和βGase随机作用纤维素的无定形区. 1950 年,Reese等阐明没有一种纤维素酶生产菌能生产出分解棉花中的天然纤维素的酶,但发现有的菌株生产的酶能分解膨润的纤维素或纤维素诱导体等非晶体性纤维素,因而提出了由于天然纤维素的特异性而必须以不同的酶协同作用才能分解的C1Cx假说. 这个假说认为:当纤维素酶作用时,C1酶(内切葡聚糖酶)首先作用于纤维素结晶区,使其转变成可被Cx酶(外切葡聚糖酶)作用的非结晶形式,Cx酶随机水解非结晶纤维素,然后β-1,4 葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖, C1Cx假说的酶解机理但Wood在研究木霉(Trichoderma-reesei)、青霉(Penicilli-umfuniculosumde)的纤维素酶水解纤维素时,发现培养液中 2 种外切酶在液化微晶纤维素和棉纤维时具有协同作用. Thonart也发现2 种外切酶(CHI I和CBH II)具有协同作用. Kanda等人还发现了只是对可溶性纤维素进攻方式不同的 2种内切葡聚糖酶在结晶纤维素的水解过程中也具有协同作用. 目前认为纤维素酶水解纤维素的协同作用为:EG(C)酶随机水解切断无定形区的纤维素分子链,使结晶纤维素出现更多的纤维素分子端基,为CBH(Cx)酶水解纤维素创造了条件. CBH酶与EG酶再共同作用得水解产物纤维二糖,由BG酶水解成葡萄糖. 因而纤维素酶水解结晶纤维素的过程可以简单表示为:EG→CBH→BG, 这种协同作用顺序与传统的C1Cx假说相类似,都说明了纤维素的降解是纤维素酶的 3 种成分共
聚乙二醇( PEG) 是另一种被实践证实的能促进纤维素酶解的非离子型表面活化剂。PEG 的加入有利于纤维素酶扩散到分子内部水解结晶态纤维素,可以认为 PEG 与底物间的作用影响底物结构,降低了结晶区的反应活化能。此外,在酶解过程中,底物结构不断变化,表面不断更新,酶的高效选择性使溶液中游离酶分子迅速占据新的活性点继续反应,而 PEG 可及时吸附于非活性( 如木质素) 表面避免酶的无效吸附。PEG 分子还可降低电荷密度,减弱导致酶变性的静电相互作用,保护酶活性部位不直接与外界接触,也可有效抑制酶失活[20]。OUYANG J 等[21]经过实验得出,PEG4000 是有效的添加剂,添加量为 0. 05g / g 时,纤维素的转化率由41. 1%提高为78. 9%; 添加 PEG4000 可以使酶的活性提高 27. 5%; 经过 48h 以上的水解作用后,水解液中90% 以上的酶能够保持最初的活性。曾晶等[22]分别以湿氧化、稀酸常压水解和蒸汽爆破预处理麦草为底物,考察了不同表面活性剂及用量对纤维素酶解过程的影响,结果发现采用 PEG6000,用量为 0. 05g/g 底物时,纤维素酶水解效率最高。
3. 研究的基本内容与计划
1)实验必须的分析方法(三素的测定、酶活力的测定、葡萄糖浓度、蛋白浓度的测定)
(2)原料成分分析(纤维素、半纤维素、木质素含量的测定)
(3)不同底物酶解的最佳底物浓度(酸曝渣、纸浆、微晶纤维素)
4. 研究创新点
1)研究外源添加物peg对酶解效率的影响
(2)从不同层面综合考察peg对底物酶解的影响:
①酶活力测定评价;
