泡菜中具有降胆固醇作用益生菌的筛选及鉴定开题报告

全文总字数：4768字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.课题的意义随着生活水平的提高及膳食结构的变化，人们对高脂肪、高胆固醇食物的摄入逐渐增多，导致动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病患者的数量不断增加。

因此，研究和利用具有降胆固醇功能的微生物以降低食品和人体血清中的胆固醇，对改善人们的健康水平有重要的意义。

益生菌是一类获得对人体有益的微生物，不同益生菌具有多种不同有益功能，包括改善胃肠道功能、调节机体免疫功能、降低血清胆固醇、促进营养成分吸收和去除重金属等，而降胆固醇活性是近年来不断引起重视的有益作用之一。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究的目标1）研究从泡菜中提取的乳酸菌的对肠胃道环境的耐受度，筛选出耐受性具佳的菌种；2）研究经过筛选的耐肠胃环境菌种对胆固醇的降解能力，从中筛选出降解效率高的乳酸菌菌株。

2.研究的内容1）研究从泡菜中提取的乳酸菌的对肠胃道环境的耐受度；2）研究经过筛选的耐肠胃环境菌种对胆固醇的降解能力。

3.拟解决的关键问题1）模拟体外胃肠道环境中来研究乳酸菌耐胃酸耐胆盐能力的模型的确定；2）体外研究乳酸菌降解胆固醇的能力的方法的确定。

3. 研究的方法与方案

1.拟采取的研究方法1）模拟人体胃肠道条件下的耐受试验1.1耐酸实验①取8ml菌液，3 000 r/min、4 ℃离心10 min收集菌体；②将菌体细胞用8ml PBS 缓冲液(pH1.6)洗涤两次，加入8ml模拟胃液，制成菌悬液。③取0.8ml菌悬液，加7.2ml生理盐水，稀释5个梯度，在0、2h时选取10^-4/10^-5/10^-6梯度菌液1ml倾注平板计数。④在 37℃培养，24h后进行计数。1.2耐碱实验①取8ml菌液，3 000 r/min、4 ℃离心10 min收集菌体；②将菌体细胞用8ml PBS 缓冲液(pH7)洗涤两次，加入8ml模拟肠液，制成菌悬液。③取0.8ml菌悬液，加7.2ml生理盐水，稀释5个梯度，在0、2h时选取10^-4/10^-5/10^-6梯度菌液1ml倾注平板计数。④在 37℃培养，24h后进行计数。2）体外降胆固醇试验按OD₆₀₀将1mL胆固醇一磷脂酞胆碱胶束与9mL的MRS培养基充分混匀。培养基接种1%(v/v)的新鲜细菌培养物在37℃培养48h。然后，将菌悬液离心(12000r，40℃，10min)，并使用邻苯二甲醛方法估算胆固醇浓度。所有实验平行三次。显示超过60%胆固醇降低率的菌株被选择用于进一步的体内测试。2.技术路线 获取泡菜中提取的乳酸菌 （活化后的菌液离心去上清，用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀两次）

制备模拟肠胃液处理后的菌悬液 （胃蛋白酶 NaCl溶液，配制成0.27mg/ml，pH2.0的模拟胃液； 胰蛋白酶 NaCl溶液，配制成0.4mg/ml，pH8.0的模拟胃液。） 倾注平板培养（取用生理盐水稀释后的菌悬液1ml于培养皿，倾注15ml半固体培养基混合培养） 菌株存活率情况研究 胆固醇降解力研究（于0、2h进行倾注平板培养，24h后计数） （领苯二甲醛法） 根据平板计数计算菌株存活率，研究益生性。 根据吸光度计算出前后胆固醇含量，研究对胆固醇的降解能力。3.理论与技术可行理论可行性：前人的研究已证明可以通过体外模拟肠胃道环境来研究菌种的耐受力。如郭东起等人通过科学的方法经体外降胆固醇能力实验、耐酸耐胆盐实验、细胞黏附实验和抑菌实验分离筛选出了6株具有降胆固醇功能的乳酸菌。同时，邻苯二甲醛法测胆固醇降解量简单可行，能高效比较出菌株的胆固醇降解力。实验手段可行性：随着现代精密仪器技术的发展，各种仪器的综合使用给实验数据的分析提供了真实、准确、有效的方法；无菌条件的完备也有利于实验的高效进行。本项目拟采用的实验技术和方法主要有模拟体外肠胃道技术、乳酸菌培养技术、倾注平板法计数和邻苯二甲醛法测胆固醇降解量，这些实验技术和方法均较为成熟，并且多数实验技术已在我们的研究工作中得到应用，因此本课题的实验方法与技术是可行的。

4. 研究创新点

1.本课题拟利用体外模拟人体消肠胃道环境来研究乳酸菌的耐受力，在实验方法上具备创新之处。

2.本课题拟对泡菜中乳酸菌的益生性进行研究筛选，在研究内容方面走在前沿。

5. 研究计划与进展

1、2018年12月-2019年1月：进入实验室熟悉环境和注意事项，确定完整实验流程并解决部分实验困难。

2、2019年3月-2018年4月：研究模拟人体胃肠道环境下的乳酸菌耐受力，筛选出耐受力较高的乳酸菌菌株。

3、2019年4月-2019年5月：研究乳酸菌体外胆固醇降解能力，筛选出降解力较高的乳酸菌菌株；撰写毕业论文。