1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
在食品大分子营养物（油脂、蛋白质、淀粉）中，蛋白质诱发饱腹感的能力最强。食物在胃肠消化道中主要通过机械刺激和体液刺激两种方式诱发人体的饱腹感。降低食物的消化速度，延长其胃排空时间，能够诱发人体的饱腹感，控制食欲，从而达到控制体重的目的。蛋白质和多糖能够通过分子间的静电力、范德华力、疏水作用力、氢键作用力等发生相互作用形成复合物。它们之间的相互作用主要受环境ph值、盐浓度、温度等的影响。食品蛋白质与多糖能够相互作用形成可溶性的，或者不溶性的蛋白质-多糖高分子复合物，如：高分子水凝胶、复合多层膜、可溶性高分子复合物颗粒和不可溶性的高分子凝聚物等。食品中经常应用蛋白质-多糖的高分子复合物结构来改善食品质构、口感、增强油-水乳液的稳定性和作为输送营养与活性物质的载体。正常人体胃酸的ph值范围在1.2到2.5之间，能够酸诱导蛋白质多糖复合物自发形成胃内凝胶。
相比于普通溶液而言，蛋白质-多糖复合凝胶在胃内的保留时间更长，胃排空时间更短。另一方面，多糖-蛋白质复合凝胶能够在影响蛋白质消化速率方面发挥重要的作用。复合凝胶中多糖的存在可能会引起蛋白质的物理性质和构象发生变化,影响蛋白质的消化率。凝胶结构中，多糖通过静电相互作用屏蔽消化道蛋白酶消化、降解蛋白质的作用位点，从而降低蛋白质的消化速率。因此，通过制备能够在胃液条件中自发形成凝胶的蛋白质多糖复合物饮料，能够实现控制食物消化率，延长胃排空，增加饱腹感的目标。乳清蛋白是指溶解分散在乳清中的蛋白质，约占乳蛋白质的18%～20%，具有营养价值高、易消化吸收、含有多种活性成分等特点，是公认的人体优质蛋白质补充剂之一。乳清蛋白的等电点在ph5.0左右，具有良好的凝胶形成特性。黄原胶具有大分子特殊结构和胶体特性，从而具有多种功能。黄原胶无毒、安全、低浓度、有高粘性,可控制最终产物的流变性,可以控制产品的外观、结构和风味。因此也被广泛用于罐装、瓶装食品，面包，奶制品和饮料等[1]。电荷相反的蛋白质和黄原胶在胃部酸性条件下,可以产生高度聚合甚至发生凝胶反应,生成凝胶复合产物，这改变蛋白质的消化情况和延缓胃排空。应用其分子间的静电相互作用，形成胃内凝胶，从而延长胃排空时间，降低蛋白质消化率，增强饱腹感。因此研究黄原胶对食品蛋白质消化特性的影响，对于消除食物消化的不良影响，控制肥胖人群的体重等具有重要的指导意义。开发这一类新型的食品功能饮料具有重要的价值。
作为食品结构化所必需的大分子物质,多糖、蛋白质等食品胶体在现代食品设计中发挥着至关重要的作用[2]。目前很多研究都关注于大豆分离蛋白与带相反电荷的多糖形成的水解胶体的构造，已知的信息中很少有关于复合物在胃肠环境下反应变化的研究。胃肠道的ph环境相当复杂的，胃酸ph范围一般在1.2到3.5之间，为大豆分离蛋白和带相反电荷的多糖如黄原胶的相互作用创造了天然的环境。蛋白质是所有微量营养物中最能提高饱腹感的物质，它可以运用到体重管理和肥胖控制。营养物质在胃肠道内的利用率主要由食物的消化情况决定。延缓胃排空可能会起到饱腹作用，因此通过减慢某种食物的消化速率可以增加其饱腹感，也可通过各种食品加工方法改变蛋白质上消化酶的酶切位点。报道显示，通过蛋白质与其他食物的成分相互作用能潜在地操纵蛋白质的消化速率。在模拟胃环境内，磷脂酰胆碱和其他生理的表面活性物质与乳蛋白、α-乳白蛋白以及β-乳球蛋白的相互作用，减缓了蛋白质在试管模拟胃环境内的消化速率。事实上，多糖包括果胶、黄原胶、卡拉胶和木胶也可以降低β-乳球蛋白对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的敏感性。然而几乎没有项目研究蛋白质与带阴离子的多糖经胃环境诱导形成的复合物对消化效果的影响。于此，我们旨在研究蛋白质与带阴离子的多糖经胃环境诱导形成的复合物的结构变化以及对蛋白质在胃环境内消化影响。
2. 研究的基本内容和问题
项目研究目标及主要内容研究目标：（1）阐明胃酸诱导的乳清蛋白-黄原胶凝胶的形成机理 （2）揭示乳清蛋白-黄原胶凝胶在人工胃液中的消化及影响消化因素
研究内容： （1）黄原胶的电荷密度对乳清蛋白凝胶形成的影响（2）不同黄原胶分子量、电荷密度和浓度对乳清蛋白消化率的影响（3）不同质量比的多糖蛋白对黄原胶与乳清蛋白复合物的凝胶强度的影响。
拟解决的关键问题：
3. 研究的方法与方案
研究方法：（1）材料准备：乳清蛋白，黄原胶，酶活动高于250单位的胃蛋白酶。（除非另有规定,所有使用的化学用品的纯度均为分析纯）（2）制备凝胶：先对乳清蛋白与黄原胶进行热处理，形成乳清蛋白-黄原胶复合物溶液，然后溶液在0.34mol的NaCl和pH为1.2的HCl组成的人工胃液（SGF）环境中形成凝胶 Ⅱ、黄原胶-乳清蛋白凝胶结构与性质研究：（1）利用扫描电镜（SEM）分别观察未经过蛋白酶消化和消化1小时后的卡拉胶-乳清蛋白凝胶的微观结构；（2）利用Kinexus流变仪测定卡拉胶-乳清蛋白凝胶的流变学特性，观察凝胶经过一夜时间后的变形，分别测定弹性系数，粘性系数和张力系数；（3）利用Laemmli改良后的SDS-PAGE法进行电泳，通过Thermo Scientific PageRuler 预染蛋白Ladder的SDS-PAGE条带图谱测定SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳期间的蛋白质消化程度。 />
技术路线：见附件
实验方案：
1.2.1加热乳清蛋白和黄原胶混合液
乳清蛋白纯溶液： 使用蒸馏水溶解乳清蛋白在室温下搅拌过夜。黄原胶根据溶解度采用08%的浓度用蒸馏水溶解在环境温度下搅拌过夜。蛋白质和多糖混合液被保存在冰箱里(40C)放置4小时进行水化作用。乳清蛋白和黄原胶混合液是用4%浓度的蛋白质溶液分别按照黄原胶与蛋白质质量比从0.01到0.125，黄原胶与蛋白质质量比从0.01到0.25。将混合物的pH值调整到7.0。混合物在85 ℃下水浴30分钟,然后用冰水浴冷却。
1.2.2多糖蛋白复合物的结构表现以及消化情况
1.2.2.1多糖蛋白复合物加入到模拟胃液中
用经过稀释且PH值为1.2的盐酸溶液作为模拟胃液。冷却后的乳清蛋白黄原胶混合液加入到装有SGF的透明瓶子中，观察复合物在模拟胃肠环境中的结构变化，并进行拍照。
1.2.2.2 用胃蛋白酶来消化多糖蛋白复合物
经过反复多次试验最终确定合适的胃蛋白酶浓度为胃蛋白酶与蛋白质质量比为1：200.消化样品在37℃水浴，100rmp条件下，定期在5 10 30 60 90 120分钟时取样。多糖蛋白复合物消化前后分别用扫描电镜进行结构分析。
1.2.3 流变特性
多糖蛋白质复合物在胃液中消化后的流变特性使用流变仪(Anton Paar, Physica MCR 301, Austria)进行测定。样品处理后的直径约为50mm，厚度大约为2mm。使用注射器吸取20ml多糖蛋白混合液注射到胃液中形成一个直径大概为50mm的凝胶块，测定前将凝胶块与模拟胃液一起防止隔夜使PH值平衡。次日将凝胶切割成直径为50mm 高为2mm的圆柱体。使样品均匀分布铺满整个板的表面区域。然后在室温25℃下，以1赫兹，0.5%应变测定样品的弹性模量和粘性模量，表征其成胶强度。
1.2.4 电泳
用SDS-PAGE来分析不同消化时间的样品，制备5%的浓缩胶和12%的分离胶。使用的仪器为Bio-Rad Miniprotein 3 unit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)，上样样品在加入电泳槽之前在95℃下加热十分钟，然后在1350rmp下离心十秒钟后用移液枪吸取10μL进行上样。电泳结束后使用考马斯亮蓝染色R250在乙酸:甲醇:水(1:5:4)染色溶液中进行染色，在摇床转速60-70rmp下,用乙酸:甲醇:水(1:3:8)配置的脱色液进行脱色处理。凝胶成像系统 (Clinx Science Instruments, Shanghai, China).
1.2.5 扫描电镜
将多糖蛋白混合液加入到模拟胃液中形成的凝胶，放入到氢氧化钠溶液中使酶失活
即保持最初的凝胶微观结构。同样方法取已经消化了一小时后的凝胶直接放入氢氧化钠溶液进行失活处理。两个经过上述处理后的凝胶标本在40℃下放置在2%戊二醛中过夜处理。用0.1mol二甲胂酸钠缓冲液每隔15min冲洗一次，一共进行三次。洗涤凝胶样品使用30%-100%浓度不等的乙醇水溶液进行脱水处理。脱水样本达到干燥临界点后使用Sputter Coater (EMS575X, Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA)进行扫描电镜分析。使用加速电压为15KV的SEM (S-3000, Hitachi Science System Ltd., Hitachinaka, Japan)进行扫描结果观察。获得放大2500倍的数码显微图。
可行性分析：凝胶蛋白可以诱导产生饱腹感,从而可能会被用于体重控制方面。虽然反应机制尚不完全清楚，但是多糖-蛋白质凝胶可能在产生饱腹感和影响食物消化速率方面起到重要作用。基质蛋白中多糖的存在可能会引起蛋白质的物理性质和构象发生变化,影响蛋白质的消化率。因此对蛋白酶切割位点的可访问性可能会通过多糖的静电作用而被改变。我们的方法可以很好地控制食物消化率，在享受食物的同时消除一些不良反应。根据之前的实验结果表明,蛋白质和多糖的凝胶混合物可能会使胃内的凝胶多糖的浓度要低得多,另一方面根据实验结果表明在短期的食物摄入量中胃排空率扮演了一个很重要的角色。食物缓慢降解率可以延缓胃排空,从而增加饱腹感。据报道,一些胃内粘性多糖可能在特定浓度形成凝胶和延缓胃排空。考虑到电荷相反的蛋白质和多糖在胃部条件下,它可以产生高度聚合甚至发生凝胶反应,这可能改变蛋白质的消化情况和延缓胃排空。
4. 研究创新点
近些年，由于肥胖和食物过敏等与饮食相关的疾病增加，科研工作者对提高胃肠消化蛋白质的机制这一课题的兴趣也逐渐增加。而在模拟胃液环境下，带有相反电荷的多糖和蛋白质比较容易发生高度聚合发生凝胶化反应，从而改变蛋白质的消化情况，使人们在享受食物的同时可以消除一些不良反应，也可以应用于体重控制方面。
5. 研究计划与进展
研究计划： 2016年10月2016年11月 资料收集、制定详细研究计划，制备模拟胃环境诱导的黄原胶-乳清蛋白凝胶，对凝胶进行表征 2016年11月2017年03月 在模拟胃液模型中检测黄原胶-蛋白凝胶对蛋白质消化情况的影响 2017年03月2017年04月 利用扫描电镜观察对比消化的样品和未消化的样品，探究微观结构的不同 2017年04月2017年05月 优化实验过程，完成研究报告并准备课题验收，完成毕业论文。
预期进展：掌握制备多糖-蛋白质凝胶的实验方法以及影响蛋白质-多糖凝胶消化的因素；尝试将不同的蛋白质以及多糖进行络合凝胶化，探索出不同蛋白质与不同多糖的凝胶化情况。
