1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1 国内外对冷冻肉的研究进展
国内已有较多学者对冷冻肉类进行研究。黄鸿兵[1]等学者专门详细研究冷冻猪肉中的冰晶；王丹竹[2]、谷小慧[3]、李伟明[4]的研究中均有保水性、腐败指标的试验，但学者们对颜色变化、微生物变化、剪切力变化研究较少。国外方面，诸如ju-hui choe[5]、payne s r[6]、yuan h. brad kim[7]、y.h.b. kim[8]中的研究中，对肉类的剪切力变化、保水性、蛋白质降解有着较多的分析；国外的文献中也有很多对冷冻肉类微生物的研究，如margareta lacramioara zara[9]、s patricia nassos[10]、wells[11]；也有对颜色的研究。综合来看，国内外对于冷冻肉类保水性、腐败指标、微生物变化、组织结构与冰晶形态这些方面有着很详细的资料，大多数研究中都会进行保水性与腐败指标的检测。国内的文献中，在肉体中冰晶的理化性质、肉类的组织结构方面介绍详细，国外的研究则对于微生物和颜色变化更加具体。但总体上对冷冻肉类尤其牛肉的研究中，缺乏系统全面的探究。
2 冷冻肉的应用现状
2. 研究的基本内容和问题
1 项目研究的目标：
本项目通过分析现有冷冻方式下的生牛肉贮藏过程中各项指标变化，选取合适的贮藏温度，找寻合适的冷冻贮藏方式，以达到延长生牛肉的保质期。
2 研究内容：
3. 研究的方法与方案
一、指标测定方法
（一）品质指标
1 颜色 色差仪测量肉样肉色的L、a*、b*值，测试样品前使用白板校准色差仪，肉样测定仪器上记录L、a*、b*的数值，重复数为5次。
2 解冻失水率 将铁丝网置于搪瓷盘内，使铁丝网与搪瓷盘底部的距离大于2cm。从抽取的试样中取1000g~2000g，用电子秤称量后置于铁丝网上。在试样上覆盖塑料膜，使试样在15℃~25℃自然解冻。待试样中心温度达到2℃~3℃时去掉塑料膜，用电子秤称量。再将试样置于铁丝网上放置30min，称量。重复放置30min的操作，直指连续两次称量差不超过2.0g。
2 剪切力
3.1样品处理:去肉羊长宽高不少于6cm3cm3cm的整块肉样，剔除肉表面的筋、腱。膜及脂肪。取中心温度为0℃~4℃的肉样，放入功率为1500W恒温水浴锅中80℃加热，用热电偶测温仪测量肉样中心温度，待肉样中心温度达到70℃时。将肉样取出冷却至中心温度为0℃~4℃。将肉样沿与肌纤维平行的方向切成直径1.27cm的长方形肉样，肉样长度不少于2.5cm，取样位置应距离样品边缘不少于5mm，两个取样的边缘间距不少于5mm，剔除有明显缺陷的孔样，重复数为5次。
3 失重 冻前重量W1，冻后解冻前W2，解冻后重量W3，重复数为3次。
（二）组织学指标
1.平行于肌肉纤维切割成0.5cm x 0.5cm x 1cm的长方体肉柱，迅速置于冻存管中并保存在液氮罐中，冷冻充分后切片，做垂直于肌肉纤维方向的10mm切片（重复数为3次），染色（详见试剂盒）。
2.染色后的切片用相差显微镜(BX41, Olympus, 日本)4倍物镜下进行观察、拍照（DP12, Olympus, 日本），每个切片拍10张照片。
3.用Image-Pro Plus 软件(5.1，Media Cybernetics Inc., USA)测量肌纤维直径。测量时，每张照片随机至少选择10个测量点。最终，每个样品的肌纤维直径至少为100个测量值(1010)的平均值。重复数为3次。
（三）腐败指标
1 细菌总数
根据国家标准《食品微生物学检验 菌落总数测定GB 4789.2-2016》测定牛后腿肉样品的细菌总数。具体操作如下：
称取25g牛后腿肉样品置盛有225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1.5min（速度为3档，8次挤压/s），制成1：10的样品匀液。用1mL无菌吸管吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中，振摇试管，制成1：100的样品匀液。按上述操作制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。根据对样品污染状况的估计（初始菌落数量：100cfu/g以下），选择2个~3个适宜稀释度的样品匀液，在进行10倍递增稀释时，吸取1mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。及时将15mL~20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养基（PCA，北京陆桥技术有限公司）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，36℃1℃培养48h2h，后进行菌落计数。每个样品做3个重复。
3.2大肠菌群
根据国家标准《食品微生物学检验 菌落总数测定GB 4789.3-2016》测定牛后腿肉样品的大肠菌群。具体操作如下：
称取25g牛后腿肉样品，放入盛有225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1mi n~2mi n，制成1:10的样品匀液。用1mL无菌吸管吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入9mL生理盐水的无菌试管中，振摇试管，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释 1次，换用1支1mL无菌吸管。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min。
初发酵实验：每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液，每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL，36℃1℃培养24h2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h2h产气者进行复发酵试验（证实试验），如未产气则继续培养至48h2h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
复发酵试验（证实试验）：用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃1℃培养48h2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
大肠菌群最可能数（MPN）的报告：按复发酵试验确证的大肠菌群BGLB阳性管数，检索MPN表，报告每g样品中大肠菌群的MPN值。
3.3嗜冷菌
根据国家标准《食品和动物饲料中嗜冷微生物计数方法SNT 1615-2005》测定牛后腿肉样品的嗜冷菌总数。具体操作如下：
称取25g牛后腿肉样品置盛有225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1.5min（速度为3档，8次挤压/s），制成1：10的样品匀液。用1mL无菌吸管吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无菌试管中，振摇试管，制成1：100的样品匀液。按上述操作制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。选择2~3个适宜稀释度的样品匀液，每个稀释度各接种两个平板计数琼脂，用灭菌吸管吸取0.1mL液体加到相应每一个做有标记的平板计数琼脂（PCA）平皿中央。用已灭菌的涂抹棒将琼脂平板表面的接种物尽可能快地涂抹均匀，直到琼脂表面不再有可见的液体位置，设一个不含接种物的琼脂平板作为对照。将接种好的琼脂平板倒置放入6.5℃培养箱中，培养10d后计数。每个样品做3个重复。
4 挥发性盐基氮
根据国家标准《食品中挥发性盐基氮的测定GB 5009.228-2016》测定牛后腿肉中挥发性盐基氮。具体操作如下：
牛后腿肉去除皮、脂肪、筋腱，取瘦肉部分。称取试样20g，置于具塞锥形瓶中，准确加入100.0mL水，不时振摇，试样在样液中分散均匀，浸渍30min后过滤。将水溶性胶涂于扩散皿的边缘，在皿中央内室加入硼酸溶液1mL及1滴混合指示剂。在皿外室准确加入滤液1.0mL，盖上磨砂玻璃盖，磨砂玻璃盖的凹口开口处与扩散皿边缘仅留能插入滴管的缝隙，透过磨砂玻璃盖观察水溶性胶密封是否严密。然后从缝隙处快速加入1mL饱和碳酸钾溶液，立刻平推磨砂玻璃盖，将扩散皿盖严密，于桌子上以圆周运动方式轻轻转动，使样液和饱和碳酸钾溶液充分混合，然后于37℃1℃温箱内放置2h，放凉至室温，揭去盖，用盐酸或硫酸标准滴定溶液（0.0100mol/L）滴定。使用1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液混合指示液，终点颜色至紫红色。同时做试剂空白试验。
5 脂肪氧化（TBARS值）
5.1样品处理：称取50.001g肌肉，绞碎后加入25mL20%的三氯乙酸（TCA）（w/v）和20mL蒸馏水高速分散1min（1000rpm20s，4000rpm40s）；暗室中静置1h后离心（1000g,10min,4℃）；过滤后定容至50mL，取滤液2mL与2mL0.02MTBA溶液混合，沸水浴20min后用流水冷却5min,于532nm处测定光吸收值。重复数为3次。
5.2空白试验：空白试验取10%TCA 2mL加入2mL0.02M TBA进行沸水浴20min后用流水冷却5min，于532nm处测定光吸收值。
5.3标曲的配制：1mL注射器称取1,1,3,3-四乙氧基丙烷31.5mg，溶解稀释至100mL，相当于100ug/mL丙二醛的标准储备液。标曲的六个点：
0ug/mL
0.01 1ug/mL取300uL稀释至10mL
0.05 10ug/mL取150uL稀释至10mL
0.1 10ug/mL取300uL稀释至10mL
0.2 10ug/mL取600uL稀释至10mL
0.5 10ug/mL取1.5mL稀释至10mL
以上六瓶溶液各取2mL于10mL塑料具盖离心管中，加入10% TCA 2mL和2mL0.02MTBA进行沸水浴20min后用流水冷却5min，于532nm处测定光吸收值。
5.4 计算公式：C=根据标曲测定的浓度x 2( mg/100g)
二、技术路线
-18℃ |
牛后腿肉样品 保鲜袋包装、裸露 |
-40℃ |
-60℃ |
检测颜色、剪切力、微观结构、肌纤维直径、冰晶大小、细菌总数、大肠菌群、嗜冷菌、TBARS值和TVB值 |
统计检测指标，确定最优条件 |
验证实验 |
确定最适宜的冷冻温度和包装方式 |
三、可行性分析
本项目依托国家肉品质量安全控制工程技术研究中心，具备色差仪、数显嫩度仪、生物安全柜、螺旋接种仪、菌落计数器、正置荧光显微镜、高压灭菌锅等硬件设施，能够满足本项目相关研究的需要，保障项目的顺利实施。
本项目的原材料生牛后腿肉由采农贸市场购，其产品生产监督严格，符合本项目对试验原材料的要求。
本项目冷藏设备由海尔集团提供，海尔集团是全球大型家电第一品牌，其冰柜产品零售量连续多年蝉联全球第一，冰柜机身内部采用了最新的核心科技，拥有了非常耐用的性能，符合本项目对试验器材的要求。4. 研究创新点
1全面探究冷冻牛肉的各项指标，全面了解冷冻贮藏对牛肉保鲜的影响。
2研究冷冻牛肉最适贮藏温度，延长生牛肉的保质期。5. 研究计划与进展
2016年10月19日上午携带采样箱和冰袋至采样点取样（提前两天预约样品量），共购买牛肉48kg，用于实施的样品。送至实验室分割、称重、标记等处理后，将24kg样品放置低温冷冻冰柜（监测冻结速率），24kg样品放置深冷冰柜（监测冻结速率）。
2016年10月19日至2016年1月19日期间，定期监测并记录冰柜温度。
2016年10月26日上午从项目b中的两个冰柜中取样解冻后（监测解冻速率），分别测定失重、颜色、剪切力、微观结构、肌纤维直径、冰晶大小、细菌总数、大肠菌群、嗜冷菌、tbars值和tvb值（具体指标测定方法见附录）。
