1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
自然界中的微生物能够生产种类复杂具有生物活性的次级代谢产物，这些天然产物在生物体内主要是通过核糖体肽合酶（ribosomal peptide synthetase）和非核糖体肽合酶（non-ribosomal peptide synthetase, nrps）合成[1]。而经nrps合成的肽类具有结构复杂，后修饰途径多样化，生物活性广泛的特点，如抗菌、抗炎、抗病毒等，鉴于这类化合物重要的生物活性，许多已经被应用于食品、农业、工业和医药等领域。随着对微生物次级代谢产物合成途径的探索以及现代分子生物学技术的快速发展，通过组合生物合成技术构建杂合酶系，模块基因或结构域基因的重组、替换、敲除等手段诱导生成具有新型脂肽类化合物已成为目前的研究热点。
最近，利用基因工程手段对nrps合成酶系进行敲除、插入和模块的互换已经取得了一些研究成果。eppelmann等人[2]通过对腺苷化结构域（a）点突变策略，对srfa合成酶中的模块c-aglu-pcp中的lys239突变为gln239，成功将a结构域的底物识别特异性由glu转变成gln，获得了surfactin结构类似物。nguyen等[3]将合成达托霉素的模块dptd分别替换为cda生物合成基因簇中的cadps3和 a54145基因簇中的lptd，导致达托霉素第13位的kyn残基替换为对应氨基酸。研究者还对dptbc中的单个或多个模块进行了替换，其中一些脂肽衍生物表现出更强了生物活性[4,5]。姜建等[6]人对surfactin基因簇的模块3、5和6进行缺失，获得了一个相应位置氨基酸缺失的surfactin结构类似物。
脂肽plipastatin由于具有较强的抗丝状真菌活性和较低的溶血活性，被应用于食品保鲜和生物防治。但是，利用组合生物合成的方法修饰plipastatin合成酶系来探索新结构脂肽类化合物的形成的研究还很少。因此本研究拟通过对该脂肽合成酶系中a结构域的缺失，来生产具有新型的plipastatin类似物，扩大微生物生产脂肽的多样性，探索a结构域的缺失对诱导出现nrps新型装配模式的影响，具有重要的研究意义和价值。
2. 研究的基本内容和问题
1.研究目标
获得新型的plipastatin脂肽类似物。理论上，该类似物的氨基酸环肽上缺失丙氨酸（或缬氨酸）和脯氨酸这两种氨基酸。
2.研究内容
3. 研究的方法与方案
1.研究方法
敲除质粒的构建：以枯草芽孢杆菌pb2-l的基因组dna为模板，设计了一系列引物，分别pcr扩增了如下目的基因：plipastatin合成酶系中编码第6和7位a结构域的上游和下游基因序列；接着通过soe-pcr的方法，将上、下游目的基因连接；获得融合基因片段。再酶切、连接的方法，克隆至载体质粒pks2上，最后获得敲除质粒。
枯草芽孢杆菌pb2-l感受态的制备和转化：将目标菌株b. subtilispb2-l在lb培养基上划线，37℃培养2d；挑取单菌落接种于10 ml gm Ι溶液中，30℃、100rmin-1过夜培养；细胞培养物按1:10(体积比)转接于gm ΙΙ溶液中，37℃，200rmin-1，培养3.5 h；细胞培养物再次按1:10(体积比)转接于gm ΙΙ溶液中，30℃，100rmin-1，培养90 min；取出细胞培养物，5000 rmin-1，离心10 min 收集细胞；保留上清液，按1:10(体积比)用上清液重悬细胞，每管100 l 分装菌体，现做现用。
4. 研究创新点
抗菌肽是一类广泛存在于自然界生物体中的小肽类物质，它是机体先天性免疫系统的重要组成部分。由于抗菌肽对细菌、真菌、寄生虫、病毒、肿瘤细胞等有着广泛的抑制作用，并且随着越来越多的抗生素耐药微生物的出现，使得抗菌肽在医药行业和食品添加剂等领域有良好的应用前景。但抗菌肽的生产仍存在一些问题，例如从生物体中提取的天然抗菌肽含量极低；化学合成难以保持抗菌肽的天然结构及活性且污染较大等。组合生物合成策略可以运用基因工程的手段将基因簇中的模块或结构域进行多种自由组合，获得多种新的甚至是自然界中不能发现的衍生物，其目标产物可以由重组菌株发酵大量生产，提高产物产量、纯度以及表达率，降低生产成本和环境污染。生物合成这种手段，相比较化学合成，极大地减少了污染，是一种新型的绿色生物产品合成手段。目前许多被广泛利用的药物都是运用组合生物合成生产的天然药物的衍生物，这种手段在药物以及食品添加剂生产中有很大的运用前景。
对Plipastatin的研究，以往多集中在其合成途径上，而没有研究过其衍生物的合成。此研究利用组合生物合成的手段，对Plipastatin的NRPS合成酶系某个模块进行敲除，来获得新型的Plipastatin脂肽类似物，扩大微生物生产脂肽的多样性。
5. 研究计划与进展
2016.10-2016.11 拟定课题，阅读文献，完成文献综述
2016.11-2016.12 确定实验方案，了解实验室，确定仪器和试剂的落实情况
2016.12-2017.01 通过pcr、质粒提取的实验方法，构建重组质粒
