1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
工业上所使用的谷类淀粉中，支链淀粉的含量约占75%-85%，而支链淀粉中约含有4%-5%的α-1,6糖苷键。目前工业发酵生产酒精、氨基酸、核苷酸、抗生素等，均需要使用大量的淀粉，经过淀粉酶和糖化酶水解后生成单糖或二糖作为发酵培养基的能源。利用淀粉酶水解淀粉时，存在支链不能被切割的问题。添加脱支酶后，可以明显的提高水解效率。支链淀粉不能彻底分解则直接影响到淀粉的利用率，影响到产品的质量。脱支酶又名为支链淀粉-1,6葡萄糖水解酶，能催化水解支链淀粉、糖原以及相关的大分子化合物中的α-1,6糖苷键。近年来，随着研究的不断深入，脱支酶作为淀粉酶类的一个新品种，已广泛应用于以淀粉为原料的各种工业生产[1]。普鲁兰酶（pullulanase）是一种能够专一性切开支链淀粉分支点的α-1,6糖苷键，从而剪下整个侧枝，形成支链淀粉的脱支酶。目前，已经发现的能产普鲁兰酶产生菌有很多种，包括产气气杆菌、嗜热厌氧菌、厌氧古细菌、嗜热芽孢杆菌等[2]。普鲁兰酶与其他淀粉酶协同作用或单独作用，使食品质量提高，降低粮耗，节约成本,减少污染。普鲁兰酶能分解支链的特性决定了他在食品工业中的广泛应用，已成为淀粉酶制剂中一个很有前途的新品种，具有广阔的开发和应用前景。其在食品工业中的应用研究也将日趋广泛和深入。
普鲁兰酶在食品工业中的应用有很多：（1）生产高浓度麦芽糖：高浓度麦芽糖浆是指产品成分主要为麦芽二糖（≧50%）、葡萄糖、麦芽三糖、麦芽四糖及四糖以上等。它具有不易结晶、吸湿性小等特点，在食品工业中有着广泛的应用。此外，高浓度麦芽糖浆还可用于医药行业中作为糖尿病和肝病患者以及手术后的营养补给品。因此，麦芽糖浆中麦芽糖的含量直接关系着麦芽糖浆优良性能的发挥，并且也限制了高浓度麦芽糖的生产，原始方法是先利用细菌ɑ-淀粉酶进行原料的液化，再用麦芽自身所产的ɑ-淀粉酶进行糖化，利用乙醇沉淀除去极限糊精后，最后进行麦芽糖结晶。此种方法成本高且收益率低，收率仅为30%，所以当时精制高纯度的麦芽糖是非常困难的[4]。目前常用的方法是在糖化时条件普鲁兰酶，其与β-淀粉酶协同作用，将支链淀粉脱支而形成短的直链淀粉片段，能减少β-糊精的形成，从而提高麦芽糖的含量。据报道，普鲁兰酶淀粉酶的协同作用，可得到麦芽糖含量为924g/kg的糖化液[5]。（2）生产直链淀粉:因为普鲁兰酶具有水解a -1, 6糖苷键的特性，所以添加普鲁兰酶可直接将淀粉原料中的支链淀粉直接转化成直链淀粉。直链淀粉具有良好的徒步展开性，可用作食品的保护层或增稠剂。并且容易凝结成块从而形成结构稳定的凝胶，因此又可以作为食品包装薄膜[6]。（3）其他用途：普鲁兰酶也可与其他淀粉酶配合使用，如与糖化型淀粉酶配合使用，可使淀粉糖化完全；另外可以将普鲁兰酶应用于啤酒工业中，在酒精发酵阶段通过外加酶化剂法添加普鲁兰酶可大大提高淀粉的利用率及淀粉出酒率[7]；在实际生产中研究人员也发现利用普鲁兰酶可以将单糖或低聚糖结合到环糊精，形成改良后的歧化环糊精，从而用作稳定剂、乳化剂和抗氧化剂；直链淀粉经过普鲁兰酶脱支处理后，再经糊化、老化等过程可得到抗性淀粉，常用于改善人类的膳食结构[8]。
目前国际上普鲁兰酶的工业化生产被丹麦垄断,我国仅局限于实验室研究,且酶活较低，所以提高普鲁兰酶的产量对食品加工领域具有重要的工业价值。目前生产普鲁兰酶的菌株的产酶水平还难以满足工业生产的要求，通过对产普鲁兰酶的一株枯草芽孢杆菌发酵培养基的培养条件及发酵方法的设计与优化，进而提高普鲁兰酶的产量。目前市场上的普鲁兰酶主要由杰能科和诺维信生产[3]。杰能科的普鲁兰酶（us7968691b2）基因来自于bacillus.deramificans，采用地衣芽孢杆菌表达系统，将普鲁兰酶基因pul整合到基因组上，采用amyl的启动子和信号肽。诺维信的普鲁兰酶有不同的专利。一种（us8703465b2）普鲁兰酶基因来自于两种古细菌（themococcus. hydrothermalis和t. litoralis）。将t. litoralis的gh57结构域和t. hydrothermalis的x47结构域整合到枯草芽孢杆菌中，采用aprh的启动子和信号肽。另外一种（ep2042593a2）普鲁兰酶基因来自于b.deramificans，采用枯草芽孢杆菌表达系统。在前期试验中我们得到一株产普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌bs001的基础上，本实验主要通过对其发酵培养基及发酵方法进行了设计与优化，提高bs001的发酵酶活，为普鲁兰酶的工业化生产提供理论支持。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
目前生产普鲁兰酶的菌株的产酶水平还难以满足工业生产的要求，通过对产普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌发酵培养基的培养条件及发酵方法的设计与优化，进而提高普鲁兰酶的产量。
研究内容：
3. 研究的方法与方案
研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析
1、研究方法：
为确定最适发酵培养基的成分及成分含量，将依次从确定培养基的碳氮比、单因素实验、确定各组分的量、响应曲面实验等实验来进行。传统的优化技术(如单因素法)虽然方法简单、易行，结果较直观，但在考察多个因素时会浪费大量时间，且有可能导致不可靠的甚至错误的结论，因此，常常仅作为过程优化的初步试验。在考察多个因素时，为了减少试验次数，节省时间，通常采用统计优化技术，这是因为统计优化技术无论从试验设计到数据分析以及模型的建立与统计学密切相关，它能够以较少的试验次数获得极为丰富的统计信息。
4. 研究创新点
特色或创新之处
本实验研究的是一株产普鲁兰酶枯草芽孢杆菌的工业培养基优化方法，普鲁兰酶是一种专一性的淀粉脱支酶，作用于支链分支点的α-1，6糖苷键，形成直链淀粉，目前已广泛应用于食品工业的研究与应用中。普鲁兰酶可与其他淀粉酶协同或单独作用,使食品质量提高,降低粮耗,节约成本,减少污染。普鲁兰酶已成为淀粉酶制剂中一个很有前途的新品种,具有广阔的开发和应用前景。然而国内还没有生产普鲁兰酶的优良菌种。目前市场上的普鲁兰酶主要由杰能科和诺维信生产。杰能科的普鲁兰酶（US7968691B2）基因来自于bacillus.deramificans，采用地衣芽孢杆菌表达系统，将普鲁兰酶基因pul整合到基因组上，采用amyL的启动子和信号肽。诺维信的普鲁兰酶有不同的专利。一种（US8703465B2）普鲁兰酶基因来自于两种古细菌（Themococcus. Hydrothermalis和Themococcus. litoralis）。将Themococcus. Litoralis的GH57结构域和Themococcus. Hydrothermalis的X47结构域整合到枯草芽孢杆菌中，采用aprH的启动子和信号肽。另外一种（EP2042593A2）普鲁兰酶基因来自于bacillus.deramificans，采用枯草芽孢杆菌表达系统。在前期试验中我们得到一株产普鲁兰酶的枯草芽孢杆菌，命名为BS001。通过对产普鲁兰酶的一株枯草芽孢杆菌（BS001）发酵培养基条件及发酵方法的设计与优化，进而提高普鲁兰酶的产量。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
研究计划：
1.2016年10月初-10月中旬：确定培养基的碳氮比
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