1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1.课题的意义
石耳( umbilicariaesculenta (miyoshi)minks)又名岩耳、石壁、果皮衣，属地衣门石耳科，为中国特有的低等岩生植物，是低等植物和真菌构成的一种混合生命形态，表现出真菌的生命特性[1-3]。石耳是一种菌类食品，营养丰富，可入药，李时珍在《本草纲目》中提到石耳状如地耳，山僧采曝馈远，洗去沙土，作茹，胜于木耳，佳品也 [4]。目前石耳多糖的提取法以热水浸提法为主。但影响提取效果的因素较多，工艺还不是很完善，还需要不断优化。
本实验对影响石耳多糖提取效果的因素进行探究，并对提取工艺进行优化，可以为石耳多糖的提取提供更好的工艺参考。对石耳多糖的理化性质与抗氧化性的研究，可以为石耳多糖的开发与应用提供方向。
2. 研究的基本内容和问题
1.研究的目标
探究石耳多糖热水浸提法的制取的提取条件，并用响应曲面法对提取条件进行筛选优化。对制取的粗多糖进行提纯，得到精制多糖。再以精制多糖和粗多糖作为样品进行石耳多糖的理化性质及其生物活性研究。理化性质主要是指产品中的糖、蛋白质、硫酸基、糖醛酸的组成和含量。生物活性研究主要是进行其抗氧化活性的研究。为石耳多糖的提取及应用提供参考。
2.研究的内容
3. 研究的方法与方案
1.研究方法
单因素研究法多热水浸提法个影响因素的研究，响应曲面法对工艺的优化，Sevage法脱蛋白，再经DEAE柱子及Sephadex对粗多糖的纯化和苯酚硫酸法、考马斯亮蓝法、氯化钡明胶比色法进行其理化性质的研究。
2.技术路线
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黄山石耳粗多糖
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粗多糖 精制多糖
3.实验方案
3.1单因素法对热水浸提法的研究
热水浸提法：取适量石耳干粉，按一定料水比加入蒸馏水，稍加摇匀，置于一定温度下水浴加热。一定时间后取出，用离心机离心后取上清液，沉淀物再按原料水比加入蒸馏水继续水浴加热。重复上述步骤若干次。将制取的上清液集中，若有沉淀可再次离心。
选择提取温度、提取时间、料水比及提取次数4个单因素分别进行实验。
（1）提取温度设置50、60、70、80和90℃五个梯度，提取时间为3 h，料水比为1:20 g/ml，提取次数为3次；
（2）提取时间设置1、2、3、4 和5h五个梯度，提取温度为80℃，料水比为1:20 g/ml，提取次数为3次；
（3）提取料水比设置1:10、1:15、1:20 、1:25和1:30g/ml五个梯度，提取温度为80℃，提取时间为3 h，提取次数为3次；
（4）提取次数设置1、2、3、4和5次五个梯度，提取温度为80℃，提取时间为3 h，料水比为1:20 g/ml。
将得到的上清液经旋转蒸发器浓缩后，以三倍体积的95％乙醇进行沉淀，经24h
后，用抽滤法提取出粗制品，经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤后，干燥得到粗多糖并称量。
粗多糖的率计算公式：
粗多糖的率（%）=[粗多糖质量（g）/石耳干粉质量（g）]100%
3.2响应曲面法对实验条件进行筛选优化
利用提取温度、提取时间、料水比及提取次数四个因素作为研究对象，以粗多糖得率作为指标，进行响应曲面的研究。
采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数。根据所得的响应曲面对
四个因素进行筛选，对提取工艺进行优化，并选出对粗多糖得率影响最大的因素。
3.3 Sevage法脱蛋白
取适量粗多糖加水溶解，加1/3体积的Sevage试剂（三氯甲烷:正丁醇=4:1）剧烈震荡30 min，分液漏斗静置20 min使其分层，弃下层有机溶剂以及中间变形蛋白质，取上层多糖溶液进行多次直到中间无蛋白层为止，醇析离心得去蛋白的粗多糖。
3.4经DEAE柱子和Sephadex凝胶柱子对粗多糖进行精制
取适量粗多糖溶于尽可能少的蒸馏水中,上DEAE一cellulose柱(5.0又75em),依次用蒸馏水,0.1,0.2,0.3,0.5,1.omol/L的NaCI溶液洗脱,洗脱流速lmL/min。按管接样,每管5mL,苯酚一硫酸法隔管跟踪检测,分部收集洗脱液,对洗脱液进行浓缩干燥得到多糖。
将按上述方法制的主要多糖组分溶于尽可能少的蒸馏水中,上Sephadex G一200凝胶柱(2.0l00cm)进一步纯化,依次用蒸馏水,0.2,0.3,0.5,l.0mol/L的NaCl溶液洗脱,洗脱流速1mL/min。按管接样,每管5mL,苯酚一硫酸法隔管跟踪检测,分部收集洗脱液,对洗脱液进行浓缩干燥得石耳均一多糖。
3.5苯酚硫酸法测多糖组分
第一步先制作标准曲线：准确称取多糖20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。
以此法制作不同多糖的标准曲线。
第二步对多糖制品的含量测定：取1g多糖样品加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少许5%TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5%TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。最后一次将残渣一起到入离心管。
经离心后，在向比色管中加入2毫升6mol/L 盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L 氢氧化钠摇匀。定容至25mL的容量瓶中。吸取0.2ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。每次测定取双样对照。以标准曲线计算多糖含量。
3.6考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
第一步先制取不同浓度的蛋白质标准液，用考马斯亮蓝染色后测定其在595nm
波
长处的吸光度后制得标准曲线。
第二步用考马斯亮蓝染色法对精制多糖进行染色后测定其595nm波长处的吸光度，根据其吸光度与标准曲线进行对比，得到精制多糖的蛋白质含量。
3.7氯化钡明胶比色法测定硫酸根含量
称取3．0 mg样品于2．0 ml的安瓶中，加1．0 mol／L盐酸10 ml，封口后放人110℃烘箱水解5 h。水解液60℃减压浓缩至干。加1．0 mol／L盐酸溶液0．3 ml，溶解残渣。精密吸取水解后待用样品0．2 ml，加三氯乙酸至4．0 ml，摇匀后加1．0 ml 氯化钡明胶溶液，摇匀，室温静置15min。测360 nm处吸光值，查标准曲线，计算硫酸根含量。
3.8硫酸咔唑比色法测定糖醛酸含量
分 别 精 密 吸 取 对 照 品 溶 液 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL 于 10mL 具塞试管中, 各管加水至 1mL, 分别在冰水浴中加入四硼酸钠- 硫酸溶液 5mL, 用漩涡混合器混匀, 于沸水浴中加热 20min, 取出后立即冷却至室温, 加 0.15%咔唑溶液 0.2mL, 摇匀, 在室温下保持 2h, 在最佳测定波长下测定其吸光度，制得标准曲线。
取供试品溶液各 0.1mL, 同时做 3 个重复, 以蒸馏水同法操作为参比, 按上述标准曲线的测定法,分别测定其吸光度值, 计算样品中糖醛酸的含量。
3.9抗氧化性的测定
（1）对超氧自由基的清除能力的测定
25mL具塞试管中加入4.5mL预先于25℃恒温水浴中预热20 min0.05mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH值8.2)，再加入浓度分别为0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mg/mL的样品溶液1mL和0.4 mL 25 mmol/L邻三酚溶液，充分混匀后于25℃水浴中反应5 min，立即加入8 mmol/L的HCl溶液1.0 mL终止反应，于299 nm处测定吸光度。以相同体积的蒸馏水代替样品做空白溶液，测得空白吸光度，做三次平行试验取平均值，比较并得到清除率。
（2）对过氧化氢的清除能力的测定
以pH值7.4的磷酸盐缓冲液配制10 mmol/L的过氧化氢溶液。10 mL具塞试管中加入5 mL上述过氧化氢溶液，再加入5 mL浓度分别为0.2, 0.4, 0.6, 0.8,1.0 mg/mL的样品溶液，于210 nm
处测其吸光度。以相同体积的蒸馏水代替样品做空白溶液，测空白吸光度。以相同体积的蒸馏水代替过氧化氢溶液，测吸光度。比较三者的关系，
（3）对羟基自由基的清除能力的测定
10mL具塞试管中依次加入1 mL0.75 mol/L的邻二氮菲溶液，2 mL0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH值7.4 ) 1 mL浓度分别为0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mg/mL的样品溶液，充分混匀后加入1 mL7.5mmo1/L硫酸亚铁溶液，混匀，加入1 mLO.1过氧化氢溶液启动反应，37℃恒温水浴中保温60 min后，于536 nm处定吸光度。以1mL不同浓度的样液代替1mL过氧化氢，测定吸光度。以1mL不同浓度的样液代替1mL蒸馏水，测定吸光度。比较三者关系并得到清除率。
（4）还原性的测定
10mL具塞试管中加入2.5mL磷酸盐缓冲液(pH值6.6)依次加入2.5mL浓度分别为0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mg/mL的样品和2.5 mLl%的铁氰化钾溶液，混匀后于50℃恒温水浴中保温20min，再加入加入2.5mL10%的三氯乙酸溶液，于3000r/min离心分离1Omin。吸取上清液5mL，加5mL蒸馏水和1 mL0.1 ％三氯化铁溶液，混匀后于700nm处测定吸光度值。
4.可行性分析
实验室有完备的实验设备及试剂。
实验室的导师王昱沣副教授及各位研究生在多糖的提取及其纯化方面有丰富的经验。
有较多的关于多糖提取及分离纯化文献，热水浸提法的相关试验方法较为成熟，热水浸提法本身的实验操作比较简单。石耳多糖的理化性质的研究方法与大多数植物多糖的研究方法类似。本实验的主要的探究性研究是对多糖的抗氧化性的研究，此项探究性实验是与陈阳阳学姐一起进行，有学姐与导师的指导，此项实验能较为顺利地完成。
4. 研究创新点
四．特色或创新之处
（1）本实验选取了石耳多糖的提取工艺中的四个影响因素，选取的研究对象较全面（2）本实验用响应曲面法对石耳多糖提取工艺进行优化。其他对石耳多糖的研究中未见用响应曲面法进行工艺优化。
（3）本实验对石耳多糖的理化性质和抗氧化性进行了深入的探究，目前尚未报道对石耳多糖的理化性质与生物活性的较为全面的研究。
5. 研究计划与进展
五．研究计划及预期进展
2014.10.1-2014.10.14 文献查询及实验方案的研究确定
2014.10.15-2015.1.20 进行单因素研究实验
