1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
草莓灰霉病【1】是草莓生长和采后贮藏中的主要病害之一，给草莓的生产销售带来了巨大的损失。随着人们对食品安全和环境的重视，生物防治方法【2】逐渐取代化学防治方法，成为当前人们研究的重点。
拮抗酵母菌【3】是目前人类应用最广、研究最早、相对安全的生物防治菌，被广泛应用于果蔬采后病害。然而对于拮抗酵母菌的作用机理【4】研究进展却很缓慢。研究者把拮抗酵母菌的作用机理大致归为四点：营养空间竞争【5】、寄生作用【6】、诱导寄主产生抗病性【7】、挥发性代谢物质的抑制作用。虽然已有很多研究试验对上述机理做了相应验证，但对于酵母菌产生的挥发性代谢物质的抑制作用研究甚少。
本研究利用本实验室筛选鉴定的葡萄有孢汉逊酵母【8】，对草莓进行熏蒸处理，研究拮抗酵母菌挥发性气体对于草莓贮藏病害和品质的影响。
2. 研究的基本内容和问题
1 研究目标
确定拮抗酵母菌产生的挥发性气体的抑菌性，确定最佳熏蒸时间；研究挥发性气体熏蒸作用对草莓冷藏品质的影响。
2 研究内容
3. 研究的方法与方案
1 实验方案
本论文以红颜草莓为供试果实，以葡萄有孢汉逊酵母为拮抗酵母菌株，主要研究以下内容：
（1）研究酵母菌熏蒸处理对草莓灰霉病的防治效果，证明挥发性气体的抑菌作用。
（2）研究拮抗酵母菌不同熏蒸时间对草莓灰霉病防治效果的影响，选出最佳熏蒸时间。
（3）研究熏蒸处理对草莓冷藏品质和果实抗病性相关酶活的影响。
2 研究方法
2.1 实验材料
2.1.1供试果实
草莓果实，品种为红颜，采摘于江苏省南京市雨花台区板桥政府生态园。试验中选用七八成熟、无病虫害、无机械损伤、无腐烂、大小一致的果实。
2.1.2 供试菌株
拮抗酵母菌：葡萄有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)是由本实验室筛选鉴定，置于4 ℃PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL)上保藏。使用前要对酵母菌进行活化，用无菌接种环从斜面上取一环划线接种于PDA培养基上，28 ℃下恒温培养2 d。
病原菌：灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)由草莓果实上分离纯化得到，保藏在4 ℃ PDA试管斜面上。使用前从斜面将病原菌接种到PDA平板上，23 ℃恒温培养7 d活化。
2.1.3供试菌株菌悬液制备
H. uvarum菌悬液制备：用无菌接种环取一环活化后的菌种于装有100 mL PDB培养基（去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000 mL) 的250 mL三角瓶中，于28 ℃下180 rmin-1振荡培养24 h。随后将培养液于4 ℃，5000 rmin-1 下冷冻离心15 min，去除上清液收集菌体，并用无菌水清洗两次。血球计数板计数，用无菌水配制所需酵母菌悬液浓度，待用。
B.cinerea菌悬液制备：将少量无菌水倒入培养好的灰葡萄孢霉PDA平板上，用接种环轻轻刮下孢子，充分振荡，用八层无菌纱布过滤。取其滤液，血球计数板计数，并用无菌水配制所需孢子悬浮液浓度，待用。
2.1.4 仪器与设备
冷库，南京吉良设备有限公司；便携式色差仪，上海汉谱光电科技有限公司；XB-K-25血球计数板，国营上海医用光学仪器厂；光学显微镜Nikon102，日本尼康；TGL20M台式高速冷冻离心机，湘仪仪器有限公司；HH-6恒温水浴锅，国华电器有限公司；恒温恒湿培养箱， 宁波海曙赛富实验仪器厂；手持糖量仪WYT-4型，泉州光学仪器厂；HZQ-F160全温振荡培养箱， 太仓市实验设备厂；SW-CJ-JD超净工作台，苏州安泰空气技术有限工司；HVE-50自动蒸汽灭菌锅，Hirayama有限公司； BSA124S-CW电子天平，上海精科仪器厂；TA.XT2i质构分析仪， 英国Stable Micro Systems公司；UV-2802PCS紫外可见光分光光度计，北京莱伯泰科有限公司；
2.2 实验方法
2.2.1挥发性气体对草莓灰霉病的防治效果
将草莓用1105 sporemL-1的灰霉孢子悬浮液浸泡，晾干后放于干燥器上部，下部放6个小培养皿。 CK：培养皿无酵母； 处理组：每块培养皿涂布200ul 1109 CFUml1葡萄有孢汉逊酵母菌悬液。密封，常温贮藏，观察发病情况。
2.2.2挥发性气体不同处理时间对草莓灰霉病的防治效果
将草莓用1105 sporemL-1的灰霉孢子悬浮液浸泡，晾干后放于干燥器上部，下部放6个小培养皿，每块培养皿涂布200ul 1109 CFUml1葡萄有孢汉逊酵母菌悬液。CK：熏0天；处理组1：熏1天；处理组2：熏2天；处理组3：熏3天。密封，常温贮藏，观察发病情况。
2.2.3活性炭的添加对挥发性气体防治效果的影响
将草莓用1105 sporemL-1的灰霉孢子悬浮液浸泡，晾干后放于干燥器上部。CK：干燥器底部放置未接种酵母的培养皿；处理组1：干燥器底部放置接种过酵母菌悬液的培养皿；处理组2：干燥器底部放置接种过酵母菌悬液的培养皿，同时在底部加入50g活性炭；密封，常温贮藏，观察发病情况。
2.2.4挥发性气体对草莓冷藏贮藏品质的影响
8个大干燥器，每个干燥器上层放75颗6，7成熟草莓，下层放8个大培养皿。常温对照：培养皿不接酵母，干燥器密封，常温放置3天后取出冷藏；常温处理：每个培养皿涂布500ul 1109 CFUml1酵母菌悬液，干燥器密封，常温放置3天后取出冷藏；低温对照：培养皿不接酵母，干燥器密封，低温放置3天后取出冷藏；低温处理：每个培养皿涂布500ul 1109 CFUml1酵母菌悬液，干燥器密封，低温放置3天后取出冷藏。每隔3天测指标，品质指标：腐烂指数、商品率、失重率、色差、质构、PH。
2.2.4.1腐烂指数及商品率
根据果实腐烂面积大小将腐烂指数划分为5级别：0级，无腐烂，无病斑；1级，腐烂面积小于果实面积的10 %；2级，腐烂面积占果实面积的10 %～25 %；3级，腐烂面积占果实面积的25 %～40 %；4级，腐烂面积大于总果实面积的40 %。按如下公式计算：
腐烂指数=∑(腐烂级别该级果实数量)/(最高腐烂级别总果实数量)
商品率(%)=(0级草莓数量 1级草莓数量)/总草莓数量100%
每组分为3个平行，每平行10个草莓果实。
2.2.4.2果实失重率
用称量法测定果实失重率，计算方法为失重率(%)=(W1-W2)/W1100%，其中 W1表示原始重量(g)，W2表示贮藏后重量(g)。
2.2.4.3果实色差
采用色差仪测定果实表层颜色，结果用Lab表示，L表示亮度；△a 表示偏红，△a-表示偏绿；△b 表示偏黄，△b-表示偏蓝。每处理取10个果实，选取果实赤道部位左右对称部位进行测定。
2.2.4.4果实质地
采用TA.XT2i质构仪测定果实质地，利用P/50探头进行TPA测定，使用前进行校正，设置参数为：预压速度5.00 mms-1，下压速度10.00 mms-1，压后上行速度5.00 mms-1，受压变形距离为4.00 mm，两次压缩中间的停顿时间为5 s，触发力为1.0 N。每组取15个果实，结果取平均值，试验重复2次。
2.2.4.5 pH 值
用DELTA 320 pH计测定果实的pH值，测定前对其校正。取10 g草莓果肉，用研钵磨样，过滤，定容至100 mL后摇匀测量。每组取3个果实，设3个平行，试验重复2次。
3 技术路线
熏蒸用灰霉浸泡过的草莓 |
研究不同熏蒸时间对灰霉的抑制效果 |
确定最佳熏蒸时间 |
研究不同熏蒸温度对草莓冷藏效果的影响试验 |
葡萄有孢汉逊酵母 |
确定挥发性气体的抑菌性 |
4 可行性分析
本课题研究内容合理，制定的研究方法可行；实验相关设备齐全；研究者具备相关方面的知识，指导教师多年来致力于相关方面的研究，可确保完成实验。
4. 研究创新点
国内外相关领域对拮抗酵母菌防治效果以及作用机理等方面做了大量研究,但对拮抗酵母菌产生的挥发性代谢物研究较少。本实验研究拮抗酵母菌产生的挥发性气体对草莓灰霉病以及贮藏效果的影响，为拮抗酵母菌机理研究提供一定的参考。
5. 研究计划与进展
研究计划及预期进展
2014年11-12月 查阅资料、试剂仪器等的准备及预试验
2015年01-02月 熏蒸试验、冷藏试验
