1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
1. 国家十二科技支撑计划项目课题：动物源食品加工共性关键技术研究（2012bad28b01）
2. 教育部新世纪人才计划：肉品加工与质量控制ncet-11-0668
3. 国家生猪产业技术体系cars-36-11
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：
1.建立预测宰后早期猪肉僵直情况的近红外方法；
2.建立鉴别宰后早期正常肉与pse肉的近红外方法；
3. 研究的方法与方案
研究方法：见插入图片
技术路线
1、对采集得到的猪肉宰后不同时间的原始光谱进行预处理，结合化学计量学方法及品质指标的测定结果进行分析，可能发现一定的相关性；
2、PSE肉与正常肉的近红外光谱在原始光谱或者经过预处理后的光谱上存在某些差异；
3、宰后猪肉的能量代谢速率、蛋白磷酸化水平的不同可能会导致品质指标不同。能量代谢速率、蛋白磷酸化水平、品质指标（pH、WBSF、L*a*b*）、水平分布等之间可能存在一定的相关性。
4、试验设计（研究材料、方法和手段）
研究材料：正常猪肉、PSE肉
研究手段：
1、FT-NIR 傅里叶变换近红外光谱及其分析技术
2、化学计量学技术
3、品质指标（pH、WBSF、L*a*b*）测定技术
4、HPLC高效液相色谱技术
5、SDS-PAGE电泳技术
实验方案
1.品质指标（正常肉与PSE肉的比较研究）
早期研究表明，PSE肉在宰后早期（宰后45min），胴体温度还很高时，pH已下降至6.0以下，并由此导致组织蛋白酶的钝化、肌浆球蛋白等蛋白质的变性等一系列生化变化[3, 4]。同时，PSE肉的色差指标中的L*值（Lightness）显著高于正常肉[5]；由于持水力降低，导致肌肉组织中的水分溢出，可以应用低场核磁共振（LF-NMR）探究宰后PSE肉中的水分分布变化[6-8]。但这些检测技术以及指标的人工测定对样品具有破坏性或者分析时间较长，不适合现代化屠宰场标准化、无损快速分级的要求，因此有必要建立一种快速无损的猪肉品质分级方法。
将从屠宰场采回实验室的背最长肌后半段，在环境温度为0-4℃的低温操作间存放，依次测定宰后3h、5h、7h、9h、12h、24h、48h的pH、颜色L*a*b*、核磁共振T2横向弛豫参数等指标，保存数据；宰后45min, 3h, 9h, 24h分别冻存10g肉样于液氮中，转存至-80℃低温冰箱，用于测定糖原，ATP/ADP/AMP含量。
1.1 pH的测量：
便携式pH校正好后测量样品在宰后45min的pH，第一次测试45min时的校正和测试温度设为35℃，3、5、7、9、12h时测试的校正和测试温度设为20℃，24h和48h的校正和测试温度设为4℃，相应的校正用溶液也要调节到校正温度。将pH计探头插入肉中心，记录测试时肉的温度，每个样品做3次平行，取平均pH。
1.2 1.2 L*a*b*的测量：
便携式色差计测前先用白色标准板校正，宰后即取下背最长肌，待测试切面暴露在空气中20min左右,迅速测定，样品带回实验室后，迅速测定样品在3h、5h、7h、9h、12h、24h、48h的L*、a*、b*值，每个时间点之前20min,提前切好待测面，放置于空气中氧合。作好数据记录，每个样品在每个时间点测试3个平行，取平均值。
1.3 NMR的测量：
测试预热机器半小时，准备好核磁管；样品采回后，准确切取1.5g背最长肌肉样，避免取到肉眼可见的结缔组织，血管等，肉放在室温下平衡15min：测试参数设置为：核磁共振仪测定参数如下：TD: 80020，SW(kHz): 100，D3(us): 110， TR(ms): 4500，RG1(db): 28， RG2:3，NS: 16，τ(us): 200:00，Echo(nt): 5000，测试3h、5h、7h、9h、12h、24h、48h的低场核磁共振T2数据，记录测试结果；测试完后将肉放在4℃冷库中贮藏；每次测试前将切好的肉放在室温中平衡15min；核磁管清洗，烘干；反演数据，对结果进行分析。
2.能量代谢与蛋白质组学
热鲜猪肉在宰后会发生一系列的生化变化，历经僵直、解僵、成熟、腐败等四个时期[9-11]，在宰后早期，肌肉组织中含有的ATP、肌糖原等能量物质无氧酵解，导致肌肉组织中乳酸增加，进而造成pH降低；而ATP、ADP、AMP等的能量代谢亦会造成蛋白磷酸化水平的变化，通过SDS-PAGE结合Pro-Q diamond染色分析可对宰后不同时间的猪肉蛋白磷酸化水平进行分析，筛选出宰后不同时间猪肉的差异蛋白点、正常肉与异质肉的差异蛋白点，对显著变化的差异蛋白点进行MALDI-TOF-MS鉴定，以期从能量代谢组学和蛋白组学的角度对猪肉宰后品质变化及异质肉的产生做出科学解释。
2．1 能量代谢速率测定
2.1．1 ATP含量的测定
将样品采回后存放于0-4℃环境下，依次在宰后45min、3h、9h、24h取出部分冻存于-80℃。本实验测定宰后45min、3h、9h、24h能量代谢水平。准确秤取1g肉样，加入10ml 6%高氯酸中，匀浆30s，4℃下15000g离心10min，取上清液4ml加入适量0.85M KOH溶液，混匀后10000g离心10min，取上清液分装于安捷伦管中。HPLC条件设定：选择C18柱，进样量10ul，流速为1ml/min，流动相为86.5%A液（0.05M 磷酸盐 1.95mM 硫酸氢四丁基铵 pH 7.0）和13.5%甲醇。柱温25℃。
2.1．2 肌糖原含量的测定
称取一定量（小于100mg）肌肉样品，加入三倍体积试剂盒中浓碱（密度按1mg/ul计算），沸水浴20min，流水冷却。然后将糖原水解液进一步制备成糖原检测液(加16倍样品体积的蒸馏水制备成5%的肌糖原检测液)。在含有1.0mL 蒸馏水的空白管、含有1.0mL 已知浓度的葡萄糖标准液的标准管以及含有0.9mL 蒸馏水和0.1mL 糖原检测液的测定管中分别加入2.0mL 显色液，混匀后置沸水中煮5min，冷却后置于酶标仪中于620nm 波长测吸光度(A)，然后按下式计算肌糖原含量：糖原含量/(mg/g 组织)=A测定管/A标准管标准管含量(0.01mg)样本测试前稀释倍数10
2.2 SDS-PAGE法（蛋白质组学）分析蛋白质磷酸化水平[12]
2.2．1蛋白质提取
样品匀浆缓冲液的制备（500mL）：Tris碱6.057 g（100 mM），双蒸水400 mL。用1M HCl调节pH至8.3，定容至500 mL。取100 mL缓冲液，加Roche Complete抑制剂10片，Roche PhosStop抑制剂10片，混匀，贮藏在4℃条件下备用。 5% SDS溶液制备 (1000 mL)： SDS 50 g ，双蒸900mL。50-60 C 水浴溶解定容至1000 mL，常温放置。
肌原肌浆蛋白提取：取0.2g肉，加1.2 mL预冷的匀浆缓冲液， 2 30 s at 9,500 and 2 30 s at 13,500, 30 s cooling between bursts)。离心15,000g，4C)，20min。将上清液（肌浆组分）转移至两个0.5 mL离心管，每管0.5mL，-20 C冻藏；其余上清液转移至1个1.5mL离心管，稀释5倍，-20 C 冻藏，用于蛋白质浓度测定。离心沉淀溶于5 mL 5% SDS 溶液(60 C)，并转移到5mL离心管中（肌原纤维组分）。肌原纤维组分9,500 rpm匀浆30 s，80 C加热20 min, 4 C贮藏。测定肌浆蛋白组分蛋白浓度（用试剂盒）。
2.2．2 SDS-PAGE电泳
将样品采回后存放于0-4℃环境下，依次在宰后3h、5h、12h、24h取出部分冻存于-80℃。本实验测定宰后45min、3h、9h、24h蛋白磷酸化水平。称取一定量的样品，经匀浆、离心、提纯、SDS-PAGE后观察正常肉与PSE肉的条带差异，采用MALDI-TOF-MS进行鉴定。
2.2．2．1 样品准备
表一：上样体系
名称 | 体积 |
样品 | X L |
XT 样品缓冲液 (4) | 12.5 L |
还原剂 (10) | 5 L |
双蒸水 | 32.5-X L |
总体积 | 50 L |
70℃ 加热10 min | 蛋白浓度：肌浆蛋白10g/10L，肌原纤维蛋白5g/10L |
2．2电泳
每孔上样10L，加电泳缓冲液。电泳时电压200V，时间约1h。胶的固定：100 mL固定液，室温下轻摇30 分钟，更换固定液，轻摇过夜。洗胶：100 mL双蒸水，轻摇至少10 分钟，重复洗2次（共洗3次）。 ProQ染色：50 mL Pro-Q Diamond 染色液每块胶，用锡箔纸包裹染色盒，以避光，轻摇90分钟。脱色：100 mL pro-Q染色脱色液每块胶，轻摇30分钟，更换脱色液两次，脱色总时间1.5小时，避光条件下进行。洗胶：100mL双蒸水每块胶，轻摇10分钟，更换双蒸水两次，总时间0.5小时。 照相（Typhoon scanner, Filter 532 nm 580 BP, laser 532nm, voltage 500V, sensitivity: Normal, Pixel size, 100 m. mode, Fluorescence. Save the image as a TIFF file.）Sypro染色（二次染色）：将胶转入干净的盒子中，50 mL SYPRO Ruby染色液每块胶，避光轻摇过夜。洗胶：100 mL sypro ruby染色洗脱液洗脱30分钟。双蒸水清洗5分钟，更换双蒸水1次，再清洗5分钟。
二次照相（Typhoon scanner, Filter 532 nm 610BP30, voltage, 470 volts, sensitivity, Normal, pixel size, 100m, mode, Fluorescence. Save the image as a TIFF file.）考马斯亮蓝染色（三次染色）：加100 mL 考马斯亮蓝染色3-4小时，轻摇。三次脱色：200 mL双蒸水，轻摇。多次换水。三次照相。
4. 研究创新点
本课题针对宰后早期猪肉品质难以被快速无损的进行预测和分级、宰后早期产生PSE肉的生化机理认识不够深入等科学问题，以近红外光谱和传统的品质指标测定为切入点，采用传统品质指标（pH、L*a*b*、WBSF）测定技术、低场核磁共振技术、蛋白组学等技术，建立预测猪肉宰后时间的近红外光谱方法，建立鉴别异质肉和正常肉的近红外光谱方法，品质指标（pH、L*a*b*、WBSF）、水分分布（低场核磁共振T2弛豫时间）、宰后能量代谢与蛋白磷酸化水平等的相关性。以期阐明PSE肉的产生机理，以及与正常肉的品质差异原因，建立快速在线的PSE肉检测方法，为产业实践提供理论指导。
5. 研究计划与进展
研究计划
2014.052014.09 查资料，预实验摸索条件；
2014.092014.12 正常肉与pse肉的品质指标、核磁共振分析；
