新型酯酶基因的筛选开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）一、本课题意义酯酶(ec 3.1.1.x)是一大类能够催化酯键水解和合成的酶类，包括脂肪酶(lipase,ec 3.1.1.1) 能够水解酰基链长度大的底物(≥10)，和羧酸酯酶(carboxylesterases,ec 3.1.1.1)[1-2] 倾向于水解酰基链长度小的底物(≤10)[3-4]。

目前，酯酶已广泛应用于食品加工领域，并逐渐在新型生物材料、生物传感器、生物医学、生物柴油以及手性药物拆分等领域被利用。

自然界中产酯酶的微生物十分丰富[5-6]，但是由于自然界中超过99%的微生物不能在当前实验条件下获得纯培养[7-9]，使来源于非培养性微生物的酯酶的开发利用受到限制。

2. 研究的基本内容和问题

一、研究目标1．从宏基因组文库中筛选新型酯酶基因2. 对筛选得到的基因进行测序，序列比对及进化树分析，判断获得的基因是否为新型酯酶基因。

二、研究内容1.宏基因组文库中具有酯酶活性克隆的获得：涂板初筛，37c培养37日，观测是否产生透明圈，划板复筛，根据是否产生透明圈，判断是否得到具有酯酶活性的克隆。

2. 亚克隆，获得含酯酶基因的dna片段：提取活性克隆，进行酶切，微胶检验，部分酶切，凝胶回收，连接载体，电转化入宿主，涂板验证，观测是否透明圈，筛选得到亚克隆。

3. 研究的方法与方案

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析一、研究方法本实验拟利用宏基因组文库的技术，通过功能筛选的方法进行新型酯酶基因的筛选。

用宏基因组技术筛选新型基因，主要序列驱动筛选和功能驱动筛选两种方法。

序列驱动筛选(sequence-driven screening)指的是利用已知的功能基因的保守序列设计杂交探针或pcr引物，后通过杂交或pcr扩增筛选宏基因组文库，最终得到目标片段的序列的方法。

4. 研究创新点

本实验拟采用宏基因组文库功能筛选方法，对文库中的菌进行筛选，得到新型酯酶的基因。

利用宏基因组技术功能筛选酯酶，首要的是构建宏基因组文库，包括样品采集，总dna的提取，载体连接，转化宿主细胞这四大步骤。

对已有的宏基因组文库进行功能筛选，能够直观，快速的获得具有酯酶活性的菌株。

5. 研究计划与进展

时间安排 主要工作内容2013年10月至2013年11月 参考国内外多篇参考文献，与导师讨论后确定实验方案；获得相关材料、配制试剂。

2013年12月至2014年1月 进行预实验，并学习制备所需的阴性对照、亚克隆载体、电转化感受态细胞等。

2014年2月至2014年4月 配制活性酯酶筛选平板，开始筛选工作，对所得阳性克隆进行亚克隆，选取酶解圈较明显的单克隆进行序列测定，获得新的酯酶基因，并对其进行生物信息学分析。