脂肪氧合酶的应用开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义：

1.深入剖析了脂肪氧合酶的结构、酶学性质和动力学性质等，增进了对脂肪氧合酶的了解；2.通过定点突变得到相对野生型更稳定、更高效的突变型lox，增强了脂肪氧合酶的实用性，为大规模工业应用创造了前提；3.初步探究lox在染料脱色方面的应用，发掘出了lox更多的应用潜力。

国内外研究概况：

2. 研究的基本内容和问题

研究目的：

本实验室前期从ncbi上搜索到原核生物鱼腥藻anabaenasp.pcc7120基因组中lox基因以双功能酶形式存在，通过构建表达载体实现了其在大肠杆菌中高效表达，并对重组酶进行了分离纯化和性质研究，为该酶在食品加工中的应用奠定了基础。但是重组鱼腥藻脂肪氧合酶由于低热稳定性和低活性限制了其工业化应用。在本文中，我们通过定点突变技术改善重组鱼腥藻脂肪氧合酶热稳定性及酶活。

研究内容：

3. 研究的方法与方案

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析：

1野生型和突变型Ana-LOX的发酵表达研究

1.1种子液培养

　　　取20μL野生型和突变型保存菌液接种于20mL含100mg/mL氨苄青霉素的LB种子液中，同时加入200mg/mL氨苄青霉素10μL，37℃、180rpm隔夜摇床培养。

1.2发酵液培养

　　　取50μL种子液接种于50mL含100mg/mL氨苄青霉素的LB发酵液中，37℃、180rpm摇床培养。检测当发酵液菌体浓度达到OD600=0.6时，加IPTG至100mg/mL，16℃、180rpm进行诱导表达16h。

2粗酶液的制备与酶活的测定

　　　将诱导表达收集到的菌体，用磷酸缓冲液(50mmol/LPBS 0.3mol/LNaCl 0.5％TritonX-100)重悬菌体，超声波破碎菌体(400W，超声5s，间歇10s，共超声15min)，4℃、10000g离心10min，收集上清液作为粗酶液。

脂肪氧合酶活性分析用亚油酸钠作为底物。酶反应体系中含有：pH9.0的Tris-HCl缓冲液2.79mL，酶液10L，底物200L，混匀后放入35℃水浴中并开始计时，反应3min后测定吸光度。酶活单位定义：在上述条件下以1min内3mL反应体系在234nm的吸光度增加0.001作为一个酶活力单位U。

3野生型和突变型Ana-LOX分离纯化

将粗酶液按照Ni-NTAHisTagKit说明书依次用含不同浓度咪唑(50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L)的洗脱液洗脱Ni-NTA柱，收集洗脱峰，测定脂肪氧合酶活性。

　　蛋白质浓度测定采用考马斯亮蓝染色法测定，以牛血清白蛋白(100μg/mL)配制标准蛋白溶液绘制标准曲线。

表1蛋白浓度的标准曲线

Table1thestandardcurveofproteinconcentration

　　　如表1配置缓冲液，于595nm测定OD值，以OD595为纵坐标，标准蛋白为横坐标，绘制标准曲线。

　　　分别以纯化前、后的酶作为样品，样品中蛋白浓度的测定除加入标准溶液改为样品液外，其余操作完全相同，通过标准曲线即可查得每毫升溶液中蛋白的含量。

4野生型和突变型Ana-LOX的酶学性质测定

4.1野生型和突变型Ana-LOX蛋白分子量的检测

　　　将纯化后的野生型和突变型Ana-LOX经过SDS-PAGE电泳（SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳），分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%，采用考马斯亮蓝R250染色，检测野生型和突变型酶蛋白分子量。

4.2野生型和突变型酶最适反应pH

　　　分别用浓度为50mmol/L的柠檬酸-柠檬酸钠(pH4-6)、磷酸盐（pH6-8）、Tris-HCl(pH7.5-9)、硼酸/硼酸钠(pH8-11)的缓冲液作为Ana-LOX催化反应的条件，测定野生型和突变型Ana-LOX最适反应pH。

4.3野生型和突变型酶最适反应温度和热稳定性

　　　将酶分别在25、30、35、40、45、50、55、65℃水浴中进行酶活测定。将酶分别在50℃的水浴中保温进行温度对酶热稳定性的实验，每个温度每隔5min取出一组样品，迅速置于冰水中，待保温结束后统一进行酶活力测定，以未处理酶液做为对照。

4.4金属离子对酶活性的影响

　　　配制0.6mol/L的NaCl、KCl、FeCl2、MgCl2、CaCl2、MnCl2、CuSO4、FeCl3这些不同金属离子溶液，在3mL反应体系中加入50L金属离子溶液，然后在室温下分别测定其酶活，以未处理的酶液的酶活设为100%。

4.5酶动力学研究

　　　分别在底物浓度为0.01mM、0.02mM、0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM条件测定野生型和突变型Ana-LOX活力，绘制酶促反应速率曲线。

　　　根据米氏方程，运用双倒数作图法（公式：1/v=Km/Vmax1/[S] 1/Vmax）绘制图表，得到直线方程，求出Vmax和Km值

5应用

　　　研究脂肪氧合酶催化不饱和脂肪酸产生氢过氧化物能够对三苯甲烷类染料脱色，采用比色法进行测定。测染料降解前后在最大吸收波长处的吸光值，苯胺蓝、亮绿、孔雀石绿和靛蓝的最大吸收波长分别为585nm、627nm、617nm和610nm。降解前后的吸光值分别为A1、A2，其脱色率用下述公式计算：脱色率（%）=（A1-A2）/A1100%。

　　　在40℃下10h后测定野生型W和突变型V2、V7、V对三苯甲烷类染料脱色效果。

4. 研究创新点

特色或创新之处：

实验通过定点突变技术改善重组鱼腥藻脂肪氧合酶热稳定性及酶活。通过对野生型LOX的突变产生优良的突变体，并将两种优势突变体进行优势重组得到优势重组体，从而得到两者的优良性状。实验通过研究脂肪氧合酶催化不饱和脂肪酸产生氢过氧化物能够对三苯甲烷类染料脱色，采用比色法进行测定。探索LOX在染料脱色方面的应用潜力，挖掘LOX更大的应用价值。

5. 研究计划与进展

实验预计耗时2个月，分为3个阶段完成：第一阶段，种子液的培养、发酵液的培养、粗酶的提取与酶活的测定，预计耗时20天；第二阶段，野生型和突变型Ana-LOX分离纯化、野生型和突变型Ana-LOX的酶学性质测定（野生型和突变型Ana-LOX蛋白分子量的检测、野生型和突变型酶最适反应pH、野生型和突变型酶最适反应温度和热稳定性、金属离子对酶活性的影响、酶动力学研究），预计耗时20天；第三阶段，研究脂肪氧合酶催化不饱和脂肪酸产生氢过氧化物能够对三苯甲烷类染料脱色，预计耗时15天。3个阶段完成后，对数据进行统一处理，作图、作表预计耗时5天。总计用时60天。