重组MTG发酵制备及性质研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1.课题意义 微生物转谷氨酰胺酶（mtg）是从微生物中提取的转谷氨酰胺酶（transglutaminase，tagase简称为tg,全称为蛋白质-谷氨酰胺r-谷氨酰胺转移酶），是1种能催化酰基转移反应的转移酶。

之所以有mtg之称主要是由于其来源的不同，tg这一词最早是由waelsch及其合作者在1959年提出的，它是1种催化酰基转移反应的酶，能在蛋白质分子间或分子内生成ε-（r-谷氨酰）赖氨酸共价键，使蛋白质分子量变大，形成强有力凝胶，从而改善各种蛋白制品的弹性、粘和性、保水性等品质。

同时由于赖氨酸的引入使蛋白质的营养价值得到了提高。

2. 研究的基本内容和问题

1.研究目标通过在实验室条件下利用微生物发酵法生产转谷氨酰胺酶，并在其基础上初步探究各个实验条件下产酶的情况，从而得出最优的培养条件以及了解该菌种在各条件下的理化性质，为以后在食品工业上扩大应用提供研究基础。

2.研究内容① 菌种的改良。

对出发菌种通过常规诱变获得高产菌株，提高转化率，并在摇瓶条件下，对可能影响其代谢的环境因子进考察，对培养条件进行优化。

3. 研究的方法与方案

1.研究方法 1.1工程菌筛选及保存 1.2 菌种培养及发酵 1.3 菌种浓度测定及酶活测定2.实验方案2.1重组大肠杆菌的培养及诱导表达将含重组质粒pmtg的大肠杆菌m15接种于含100lg/ml氨苄青霉素和50lg/ml卡那霉素的lb培养基中,37e下培养14~16 h,然后以5%的接种量接至新鲜的相同培养基中,至od600为0.5~0.7时加入1mmol/l的异丙基硫代-b-d-半乳糖苷(iptg)诱导4h。

离心收集菌体,采用sds-page分析表达产物(分离胶浓度为12%,浓缩胶浓度为4%)。

2.2 包涵体的分离和纯化将离心收集的菌体用50mmol/l的tris-hcl缓冲液(ph7.5)洗涤2次,然后将菌体悬浮于溶液a(50mmol/ltris-hcl,20mmol/l dtt,1mmol/l edta,ph7.5)中,冰浴超声破碎15min,10000g离心15min收集沉淀。

4. 研究创新点

由于该酶本身的局限性(分子交连剂,宿主菌没有抗交连的机制,会引起宿主菌的死亡),产酶水平不是很理想本实验室利用基因重组技术,克隆了谷氨酰胺转胺酶的成熟酶基因(331个氨基酸)构建了pqe-30t融合表达质粒pmtg,实现了该酶的高效表达。

目标蛋白在宿主菌内形成了包涵体蛋白,主要有以下2个原因:1是表达量高，蛋白来不及折叠成正确的四级结构;2是宿主菌缺乏促使外源蛋白正确折叠的辅助因子，如:分子伴侣和折叠酶等。

在对包涵体蛋白进行了快速纯化和体外复性的研究中发现,该酶在复性过程中极易形成沉淀，而不能复性,即使不形成沉淀，也得不到可测活性，,据推测可能在复性的过程中，蛋白与蛋白之间形成了低分子量的多聚物，加入一定量的甘氨酸可有效地减少多聚物的形成。

5. 研究计划与进展

2013年10月-2013年11月：具体实验方案的拟定2013年11月-2013年12月：工程菌筛选及保存 2013年12月-2014年4月：菌种培养及性质测定 2014年4月-2012年5月：实验查缺补漏，毕业论文撰写