1. 研究目的与意义
l-苯丙氨酸解氨酶(l－phenylalanin ammo－nialyase )缩写pal。是催化直接脱掉l-苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶。(ec0.4.3.1.5)。是1961年j．koukol，e．conn在大麦中发现的。存在于高等植物、酵母、菌类的可溶性部分。推测分子量为30万。这是一个可把苯丙氨酸用于酚类化合物合成的酶。在很多情况下，其反应成为酚类化合物合成的有步骤的速率阶段。在组织中的活性可随外界因素而发生显著变化，用光照，病伤害，植物激素处理等会使活性显著增加。另外有时还受光敏色素所支配。在多数情况下，在组织中活性增加的同时，酶发生失活作用，这时组织中具有活性酶的量很快就会减少，据认为，这种失活是与类蛋白质物质作用有关。此外也已指出有非活性的酶的存在。
目前对苯丙氨酸解氨酶研究较少，对于潜在的应用价值和巨大的市场需求，寻找苯丙氨酸解氨酶的工业化研究，有十分现实的探究意义。从自然界中筛选天冬氨酸产生菌，得到的野生型菌株，其苯丙氨酸解氨酶基因大多都受到宿主菌的调控，苯丙氨酸解氨酶表达产量很低，难以满足苯丙氨酸解氨酶的大规模工业生产。
土壤中蕴含丰富的微生物资源，苯丙氨酸解氨酶在微生物中分布广泛，从微生物中筛选出具有新特性和高活力的苯丙氨酸解氨酶，是一项非常有意义的工作。本次实验经过初筛培养、富集培养和发酵优化培养，筛选出产苯丙氨酸解氨酶活力较高的菌株，并对目标菌株产苯丙氨酸解氨酶最佳培养条件进行了初步研究，以期为扩大苯丙氨酸解氨酶的生产源提供基础资料。
2. 研究内容和预期目标
土壤中高产苯丙氨酸解氨酶微生物的筛选并进行产酶优化。利用目标底物为唯一氮源法对土壤中的微生物进行两轮筛选，得到高产苯丙氨酸解氨酶的目标菌株。对目标菌株的发酵培养基进行单因素优化，得到最佳产酶条件。对产酶微生物的种类进行鉴定。对反应条件进行优化，得到所筛微生物酶的最佳反应条。
土壤可作为一个巨大的天然微生物库，这些微生物在自然界的进化中形成了独特的性质和催化能力。绝多数的化学反应中所需的酶类催化剂，都可以在土壤微生物中发现。土壤微生物易于培养，作为工业开发时，利用廉价易得的复合培养基，可以对土壤微生物进行大规模筛选、培养和长期保藏。简便易行，经济环保。自然界中的生物，无时无刻不在进行着天然筛选，这也形成了不同土壤中微生物所产苯丙氨酸解氨酶性能，如稳定性、活力、底物耐受性和选择性等千差万别，因此对土壤中的微生物进行详尽的筛选，发现性能更加优良的菌种，是很有必要的。
对于土壤微生物的筛选是本论文第一部分研究工作的重点。用生物发酵培养的方法对土壤产苯丙氨酸解氨酶进行筛选。首先，找到富含目的菌株的土壤，经过初筛和复筛后，选择最优菌株。第二章对筛选出的菌株经行了初步鉴定，可以判断出属于革兰氏阳性还是革兰氏阴性。最后对酶活力最高的菌株进行优化培养，筛选出最优发酵培养基组成，以期为扩大发酵规模提供资料。
3. 研究的方法与步骤
由于苯丙氨酸解氨酶广泛存在与土壤微生物中，实验开始，选择富含目的菌株的土壤，用透明圈法进行初筛。将含有目的菌株的土壤培养液涂布在含有橄榄油的固体培养基上，培养48h后，观察平板上的透明圈。有透明圈出现的地方，即是，目的菌株产苯丙氨酸解氨酶。初筛出来的目的菌株，接种环挑单菌落到富集培养基上，进行富集培养。
对筛选出来的菌株，用革兰氏染色法，进行染色，初步鉴定菌株的种类。
通过控制变量的原则，选用不同的氮源、碳源配制液体培养基。检测发酵液的酶活以及在600nm处的吸光值。选择出最优培养基配方。
4. 参考文献
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5. 计划与进度安排
| 1、2017年3月1日~2017年3月18日，了解实验目的，熟悉流程步骤，查阅相关资料，翻译文献资料，撰写绪论，； 2、2017年3月19日~2017年3月25日，准备实验所需药品，采集实验所需的土壤样品。 3、2017年3月26日~2017年3月28日，富集培养土壤目的菌株 4、2017年3月29日~2017年4月4日，初步筛选出土壤产天冬氨酸菌株 5、2017年4月5日~2017年4月7日, 挑取单菌落，只丰富培养基上，富集培养。 6、2017年4月8日~2017年4月12日，挑取菌落只丰富培养液中培养，测酶活以及600nm处吸光值，并对菌株进行革兰氏染色鉴定。 7、2017年4月13日~2017年4月18日，对酶活力最高的发酵菌株进行培养基碳源优化培养，测发酵液的酶活以及600nm处吸光值。 8、2017年4月19日~2017年4月24日，对酶活力最高的发酵菌株，选择最优碳源，进行培养基氮源优化培养，测发酵液的酶活以及600nm处吸光值。 9、2017年4月25日~2017年5月3日，撰写毕业论文初稿，完成开题报告。 10、2017年5月4日~2017年6月15日，完成论文修改。 |
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