自50 年代末，Bender 等首先对出芽茁霉(pullulariapullulans)——一种不完全菌产生的粘多糖普鲁兰(又称茁霉多糖)的结构进行了研究，发现这是一种以α-1 , 6 糖苷键将麦芽三糖头尾相连而形成的多糖。

1961 年，Bender 等进一步发现由产气气杆菌(Aerobacteraerogenes)所产生的细胞外酶———普鲁兰酶(又称茁霉多糖酶)可以切断普鲁兰中的α—1 , 6糖苷键，而使普鲁兰转化成麦芽三糖。

普鲁兰酶能够专一催化支链淀粉型多糖α-1 , 6 糖苷键的水解，从而使支链淀粉型多糖的分支链脱离主链形成一系列链长不一的直链淀粉。

将该酶与葡萄糖淀粉酶等配合使用，可使淀粉充分糖化。

国内目前使用的普鲁兰酶基本上都是来自丹麦Novo No rdisk 公司，该公司所产的普鲁兰酶则是由普鲁兰杆菌(bacillusacidopulluly ticus)菌株经深层发酵产生。

普鲁兰酶主要使支链淀粉型多糖的分支链脱离主链，从而加速糖化过程，有效的提高淀粉利用率和水解效率，降低能耗。

在食品领域，通常与淀粉酶结合使用，生产果糖和麦芽糖糖浆。

当普鲁兰酶以普鲁兰糖为原料时，水解产物主要是麦芽三糖糖浆，其在食品工业中有重要应用价值，与麦芽糖浆、葡萄糖浆等相比，其优势主要体现在：抑制食品的冰点凝固、赋予柔和的甜度、增加持水性、防止淀粉重结晶、减少色素形成等。

因此，普鲁兰酶可以在焙烤食品、甜点以及医药注射代替葡萄糖等领域中应用，在生物能源方面，以淀粉等生物质资源开发乙醇、丁醇等生物燃料也是当前能源开发的热点，这说明普鲁兰酶具有广泛的工业应用价值。

普鲁兰酶广泛分布于丝状真菌、细菌、酵母、植物和动物中，如芽孢杆菌，厌氧芽孢杆菌，水栖热袍菌，巴伦葛兹类芽孢杆菌。

然而，由于酶在产量、稳定性及特殊环境下的活性等局限，用于工业化生产的普鲁兰酶非常有限。

目前，很多研究报道了不同特性的普鲁兰酶，如嗜热栖热菌来源的耐热性达到70 ℃的普鲁兰酶；来源于嗜碱芽孢杆菌的耐受表面活性剂的普鲁兰酶。

虽然有不同特性的普鲁兰酶报道，但是特性单一，不能满足对多种特性需求的工业化生产需要，如目前淀粉糖化过程一般在60 ℃高温和pH4.5 的弱酸性条件下进行48～60 h，在此过程中普鲁兰酶不仅要维持高的催化活性还要保持高稳定性，而根据文献，符合这种多元化条件的普鲁兰酶非常有限。

本文通过对温泉普鲁兰酶产生菌酶学性质、动力学常数的研究，为深入了解该酶的催化机理及分子生物学性质研究奠定了基础。

1. 温泉普鲁兰酶产生菌的筛选

2. 温度，pH，金属离子和少数抑制剂对酶活力的影响

1、实验材料

1.1试剂配制

（1）DNS试剂：称取酒石酸钾钠122.1674 g，放入400 mL去离子水中，加热溶解后再加入3, 5二硝基水杨酸3.15g，继续加热溶解后加入氢氧化钠10.5g，加热溶解后加入苯酚2.5g，加热溶解加入Na₂SO₄·7H₂O4.9972 g(期间加热温度控制在60℃以内)，冷却后去离子水定溶至500 mL，贮于棕色瓶中避光保存，放置2周后使用。

（2）碘试剂：称取2.2g碘、4.4g碘化钾，用去离子水将其完全溶解后定溶至100 mL，贮于棕色瓶中避光保存。

（3）普鲁兰糖溶液(0.5%)：称取普鲁兰糖0.50g，加入90mL去离子水，充分溶解后定容至100ml。

（4）磷酸缓冲溶液(pH6.0、0.2 M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液)：将配制好的0.2M磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液以12.3：87.7比例混合。

1.2培养基配制

分离培养基：糯米淀粉25.0g，蛋白胨5.0 g，酵母膏5.0 g，KH₂PO₄ 0.5 g，K₂HPO₄ 0.5 g，MgSO₄·7H₂O0.1 g，琼脂25.0 g，加水定容至1000mL，pH6.0。

鉴别培养基：NaCl2.0 g，酵母膏2.0 g，蛋白胨10.0 g，红色普鲁兰糖3.0 g，琼脂25.0 g，pH7.0。

保藏培养基：同分离培养基成分；

种子培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0g，加水定容至1000 mL，pH6.0。

发酵培养基：玉米淀粉20.0g，酵母膏10.0 g，KH₂PO₄ 1.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，FeSO₄ 0.01 g，加水定溶至1000 mL，pH6.0。

培养基灭菌条件：高压蒸汽灭菌锅121℃，灭菌20 min。

2、菌种分离

2.1初筛

称取温泉水样5 mL至45 mL无菌生理盐水中，加入玻璃珠充分震荡后静置lh；取上清10ml做梯度稀释，取适宜稀释度涂板，于电热恒温培养箱中30C培养48 h；在分离平板中滴加浓度为1%的碘液适量，挑取有透明圈者，划线分离纯化，30℃培养24 h；把有透明圈的菌株转入鉴别培养基，于温箱中培养48 h后，把在红色普鲁兰板上能产生分解圈的菌株，挑选出继续纯化两次，作为复筛对象。

2.2 复筛 将初筛得到的纯化后的菌种，用牙签少量挑取，装有20 mL种子培养基的三角瓶中于，30℃的温度培养16h。再将种子培养液倒入装有40 mL发酵培养基的三角瓶中，置于回转式恒温调速摇瓶柜中进行好氧发酵，转速为200 r/min，30℃发酵48 h。

3、酶活力测定

酶活力测定参考DNS方法，取 100 μL 适当稀释后的酶液加入到 100 μL 1%普鲁兰糖溶液（100 mmol/L PBS 缓冲液配置，pH 6.0）中，45 ℃恒温反应 30 min 后，加入 300μL DNS 试剂终止反应，然后置于沸水浴中加热 5 min。取出冷却后用蒸馏水将其定容至 2.5 mL，于 540 nm 处测定吸光值。以煮沸 10 min 灭活处理后的酶液作为对照。普鲁兰酶活力的定义为：在相应条件下，每分钟分解普鲁兰糖生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活力单位（U）。

4、酶学性质测定

4.1 温度对酶活力的影响及温度稳定性

将适当稀释后的酶液与底物分别置于 25、30、35、40、45、50、55、60 ℃下反应 30min，测定重组普鲁兰酶的酶活力，以酶活力最高者为 100%对照，以探究该重组普鲁兰酶的最适反应温度。将粗酶液分别置于 35、40、45、50 ℃条件下保温 15、30、45、60、75、90、105、120 min，然后加入到底物中置于最适温度下反应 30 min，测定其剩余酶活力，以未保温处理的粗酶液的酶活作为 100%对照，探究该普鲁兰酶在不同温度下的稳定性。

4.2 pH 对酶活力的影响及pH稳定性

在最适反应温度下，将适当稀释后的酶液分别与pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 缓冲液配置而成的1%普鲁兰糖反应 30 min，测定相应的酶活力，以酶活力最高者为 100%对照，研究该酶的最适作用 pH。将粗酶液分别置于 pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 缓冲液中室温保存 1 h 后，于最适温度和最适 pH 下反应，测定其剩余酶活力，以未作处理的酶液的酶活力作为对照，探究该普鲁兰酶在不同pH下的稳定性。

4.3探究不同金属离子金属离子以及常见抑制剂对普鲁兰糖的影响

在纯酶溶液中分别添加浓度均为 5 mmol/L 的 金属盐( FeCl₃、FeCl₂、CaCl₂、CuCl₂、ZnCl₂、MgCl₂、KCl、 NaCl、MnCl₂、CoCl₂、AgNO₃、HgCl₂、PbCl₂) 和不同浓度的抑制剂( 0.2% DTT、1% β－巯基乙醇、1 mol/L 尿 素、5% SDS、5% CTAB、5% Triton X－100、5% Tween 80、2 mmol/LPMSF、5 mmol/L EDTA、30%乙醇) 分别测定酶活力，以未添加金属离子和抑制剂的酶液的酶活计为 100%，计算普鲁兰酶作用活性的变化。

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1、2022-2022-1学期17-20周～2022-2022-2学期1-4周（2022年12月23日—2022年3月20日），接受任务、查阅和翻译文献，撰写开题报告；

2、第5周~第6周（2022年3月23日～2022年4月3日），完成实验前准备工作，配制各实验所需药品。

3、第7周~第8周（2022年4月6日～2022年4月17日），预实验

4、第9周~第10周（2022年4月20日～2022年5月1日），温泉普鲁兰酶产生菌的酶学性质研究。

5、第11周~第13周（2022年5月4日～2022年5月22日），温泉普鲁兰酶产生菌的酶学动力学常数研究。

6、第14周~第15周（2022年5月25日～2022年6月5日），完成论文撰写工作。

7、第16周（2022年6月8日～2022年6月12日），完成论文答辩。