枯草芽孢杆菌无痕敲除方法建立与应用开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

1 课题的意义无痕敲除不会在枯草杆菌基因组内引入外源基因片段如抗性基因等筛选标记，并且减少其对后续试验的影响，对于枯草芽孢杆菌这种基因工程、发酵工程乃至食品工业的重要工程菌来说，无痕敲除技术是构建食品安全级枯草杆菌的新思路。

2 国内外研究进展枯草芽孢杆菌，作为重要的工程菌，利用基因敲除技术对其进行功能性改造，也已经成为构建新型枯草芽孢杆菌的常用办法。

基因敲除技术分为有疤敲除和无痕敲除，基因的有疤敲除是指在敲除后基因组中会残留一个外源序列的疤痕，这个疤痕存在有可能会影响其他基因的正常表达，或者会限制基因的进一步改造。

2. 研究的基本内容和问题

1 研究目标在枯草芽孢杆菌中，建立一种长短片段基因均适用的无痕敲除方法。

2 研究内容2.1 基因缺陷型菌株的构建以敲除元件转化枯草芽孢杆菌1a751感受态，涂布于含有相应抗性的平板，挑选单菌落，pcr验证含有敲除元件的阳性克隆子，即获得目的基因缺陷型菌株。

筛选过程中，要做抗性浓度梯度试验，找到合适的抗性浓度范围。

3. 研究的方法与方案

1.1拟采取的研究方案本实验拟采用图1所示的技术路线及下列步骤研究并建立一种在枯草芽孢杆菌中适用的无痕敲除方法。

1.1.1敲除元件的构建敲除元件中带有抗性基因的基因片段由抗性基因zeor、一段木糖诱导型启动子以及表达有毒物质的基因mazf、下游同源臂的下游序列中的一段重复序列dr序列，共四个基因片段构成。

分别设计引物以质粒psg1729为模板经pcr扩增得到zeor抗性基因，以大肠杆菌jm109为模板经pcr扩增得到木糖诱导型启动子、mazf基因，以枯草芽孢杆菌1a751为模板经pcr扩增得到dr序列。

4. 研究创新点

特色：本课题试图利用同源重组法快速构建枯草芽孢杆菌淀粉酶基因以及surfactin基因缺陷型菌株。

基因敲除完成后，脱除菌株基因组中不需引入抗性基因或其它任何筛选标记，实现了对目的基因的无痕基因敲除。

这对枯草杆菌的工业化生产及提高相关产品食品质量安全性具有重要意义。

5. 研究计划与进展

2017年10月－2017年12月：完成对枯草芽孢杆菌中短片段基因（如：中温淀粉酶基因）的无痕敲除；2018年2月－2018年4月：完成对枯草芽孢杆菌中长片段基因（如：surfactin基因的关键基因）的无痕敲除。