1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
意义：小米糠是由小米精加工时脱去的果皮、种皮、糊粉层、胚乳和少量胚混合而成，其蛋白质、纤维素、脂肪、维生素等营养物质含量丰富[1]。小米糠膳食纤维具有帮助胃肠蠕动，调节血糖、血脂等功能[2]。抗氧化肽是生物活性肽的一种，含有2~50个氨基酸，具有清除体内自由基或抑制生物大分子过氧化的功效[3]。尽管小米糠含有大量营养素和生物活性物质，但其风味差、难吸收、易酸败等问题大大降低其利用价值。目前在国内外小米糠的主要作为饲料使用或炼油[4]，而对于小米糠蛋白质、膳食纤维等的研究较少，利用微生物发酵以提高小米糠抗氧化肽、膳食纤维等功能性成分的研究则更少。纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，能够将蛋白质、脂肪、碳水化合物等大分子物质发酵分解成易被人体吸收的氨基酸、有机酸、寡糖等成分[5]。故本课题利用纳豆芽孢杆菌发酵小米糠，优化发酵条件以提高发酵液的抗氧化肽含量和活性，同时也对发酵残渣中膳食纤维进行了初步研究。本课题的设计主要为了推进小米糠资源利用的发展，通过实验改进发酵条件，以达到提高小米糠抗氧化肽含量及活性的目的，同时也为小米糠膳食纤维研究提供一个新的研究方向。
概况：国内外对于纳豆芽孢杆菌发酵小米糠产抗氧化肽的研究较少，目前活性肽的制备方法主要为酶解法，shabeena yousuf naqash等人[6]利用酶解法分解金线鱼肌肉蛋白制备抗氧化肽；郭延熙等人[7]分别采用碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶对脱脂米糠进行酶解，制备抗氧化肽，发现米糠蛋白具有较强的抗氧化活性，对多种自由基均有不同程度的清除作用。但其具有生产工艺复杂、难以进行规模化生产且副产物多难以提纯等问题[8]。国内外对于微生物发酵小米糠制备膳食纤维的研究较少，主要方法为酶解法，。tim-poner等[9]用物理挤压和酶处理法从柑桔果肉中制取膳食纤维，产品微酸，但无苦味；郑红艳等人[10]利用酶与化学结合法提取小米麸皮的膳食纤维，虽能提高小米糠的膳食纤维含量。
应用前景：利用纳豆芽孢杆菌发酵小米糠制备抗氧化肽，能够弥补酶法难以规模化生产等缺陷，从而在工业生产的市场竞争力和可行性方面都有较大的提升，对于生产抗氧化肽的产业化具有重要的现实意义和前景。同时本课题也能为微生物发酵小米糠产膳食纤维提供一条新思路。
2. 研究的基本内容和问题
研究目标：通过微生物发酵处理获得小米糠功能活性物质并提高小米糠的附加值。
研究内容：本实验以脱脂小米糠为原料，利用纳豆芽孢杆菌发酵小米糠制备抗氧化肽。通过单因素实验探讨了纳豆芽孢杆菌发酵制备抗氧化肽过程中葡萄糖、小米糠以及豆粕添加量、ph值、接种量、温度、发酵时间的影响。同时对发酵残渣中膳食纤维含量及其胆固醇吸附能力等进行了初步研究。
拟解决的关键问题：如何提高纳豆芽孢杆菌对小米糠中淀粉、蛋白的利用率，提高多肽、膳食纤维的产量。
3. 研究的方法与方案
研究方法：
1.利用纳豆芽孢杆菌发酵小米糠，离心分离上清液和残渣，用双缩脲试剂法测上清液中多肽含量，通过测定DPPH自由基清除能力以评估抗氧化肽活性，主要对其发酵条件进行研究，提高抗氧化肽的活性和产量。
2.用国标法测定发酵残渣中膳食纤维含量，通过分别测定残渣和原料的持水力、持油力、胆固醇吸附能力，比较两者数据，以进行初步研究。
技术路线：
实验方案：
1.多肽含量的测定
双缩脲试剂的配制：称取1.5gCuSO45H2O和6gKNaC4H4O6，用500mL蒸馏水溶解，边搅拌边加入300mL10%NaOH，用水定容至100mL。
标准曲线制作：分别取20mg/mL标准蛋白溶液0.0、0.1、0.3、0.4、0.5、0.6mL于洁净试管中，用双蒸水补充至1mL，加入4mL双缩脲试剂，充分混匀后，在室温下放置30min，在540nm下测吸光值。
发酵后在5000rpm离心20min，取上清液用0.45um水相膜过滤。将其与等体积10%TCA混合，静置30min后，在4000rpm下离心20min，取上清液1mL，加入4mL双缩脲试剂混匀，静置30min，在540nm处测吸光值。
2.DPPH清除能力测定
小米糠发酵过后5000rpm离心20分钟，取上清液并用0.45um的水相膜过滤，即得待测样品。样品稀释适当倍数后，实验组将样品与等体积的0.2mmol/LDPPH溶液混合均匀，对照组将样品与等体积95%乙醇混合均匀，空白组将95%乙醇与等体积0.2mmol/LDPPH混合均匀。均置于遮光条件下，室温反应30min后，在517nm下测定OD值。
3.总膳食纤维的测定
发酵残渣研磨后过80目筛后采用酶-重量测定法进行总膳食纤维含量的测定。
4.持水力测定
准确称量1.000g样品，置于大离心管中，加入20mL蒸馏水，在室温下搅拌3h，在9000rmp下离心20min，将多余的水倾斜倒出，称量样品湿重。
5.持油力测定
准确称量1.000g样品，置于离心管中，加入20mL大豆油，在室温下搅拌3h，在11000rmp条件下离心20min，将多余的油倾斜倒出，称量样品湿重。
6.胆固醇吸附试验
胆固醇标曲的制备：分别取0.1mg/mL的标准胆固醇应用液0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.30、0.35、0.40mL于8支试管中，并在各管中依次加入乙酸0.4、0.3、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0mL，各管均加入0.02mL蒸馏水、0.2mL1mg/mL邻苯二甲醛试剂、4mL混合酸（90%乙酸和等体积浓硫酸混合），各管混合均匀，在室温下静置10min，在550nm处测吸光值。
蛋液制备：取新鲜蛋黄与蒸馏水混合打成乳液（蛋黄与蒸馏水质量体积比为1:9）。
样品处理：准确称取1.000g样品于离心管内，加入25g蛋液，将pH值调为7，在37℃条件下振荡3h。在4000rpm条件下离心20min，取上清液。
样品的测定：按照表1进行试剂的添加
表1胆固醇吸附试验各试剂添加量
实验组 | 实验组空白 | 对照组 | 对照组空白 | |
上清液（mL） | 0.02 | 0.02 | ||
蛋液（mL） | 0.02 | 0.02 | ||
乙酸（mL） | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
无水乙醇（mL） | 0.2 | 0.2 | ||
邻苯二甲醛（mL） | 0.2 | 0.2 | ||
混合酸（mL） | 4 | 4 | 4 | 4 |
将各组混合均匀，在室温下静置10min，在550nm处测吸光值。
可行性：
目前国内外已有不少关于纳豆芽孢杆菌发酵米糠制备功能性物质的研究，并取得了不错的研究结果，而小米糠与米糠有很多相同之处，且有许多学者做了关于纳豆菌分解蛋白产多肽的研究，因此实验可行性很高。
4. 研究创新点
1.目前对于微生物发酵小米糠的研究本来就很少，利用纳豆芽孢杆菌发酵小米糠的研究就更少了，而利用纳豆芽孢杆菌分解小米糠蛋白可以得到易被人体吸收且具有抗氧化活性的多肽，同时又可以降低抗营养因子植酸的含量，且适于大规模生产，与传统的酶法相比更具有经济性和可行性。
2.对于小米糠膳食纤维的提取制备，目前主要以酶法为主，而利用微生物发酵小米糠制备膳食纤维的研究国内外还没有相关报道，这体现了本课题的技术创新性。
5. 研究计划与进展
2013.12-2014.01确定课题，查找相关文献，设计实验，学习相关仪器设
的使用以及微生物接种等实验操作
2014.01-2014.02各试验方法的确定
