产L-乳酸大肠杆菌代谢工程菌的构建开题报告

 2021-08-08 02:08

全文总字数:4644字

1. 研究目的与意义

L-乳酸作为优良的酸味剂和pH调节剂在食品及食品相关领域应用广泛。作为重要的手性化合物合成的前体,L-乳酸应用于手性药物和农药的合成。作为聚L-乳酸的合成原料,L-乳酸应用于生物可降解L-聚乳酸的聚合加工。大肠杆菌表达外源L-乳酸脱氢酶,可用于L-乳酸的发酵生产。但野生大肠杆菌所产乳酸多为D-乳酸,产量较低,并产生多种有机酸等副产物。本论文利用基因工程和代谢工程原理与技术,应用Red重组系统和Xer重组系统对野生大肠杆菌K12乳酸合成相关竞争途径中的酶基因进行删除,并整合来自于凝结芽孢杆菌的L-乳酸脱氢酶基因,以期获得能高效利用木糖产L-乳酸的大肠杆菌代谢工程菌。

2. 国内外研究现状分析

大肠杆菌在以葡萄糖为碳源的培养基中厌氧发酵会生成混合有机酸 (乳酸、乙酸、甲酸和琥珀酸)和乙醇,并以此来调节糖酵解中产生的还原当量。从遗学和生理学角度进行氧化还原调节,可以提高大肠杆菌的乳酸积累能力。目前,用基因改造的大肠杆菌生产乳酸的报道大多数集中在d-乳酸方面,仅有少量利用大肠杆菌基因工程菌生产l-乳酸的相关报道。liu 等在厌氧条件下通过减少还原性副产品遗传调控宿主的手段提高了乳酸产量。工程菌e. coli sdu4 能够在严格厌氧条件下积累100 g/l的l-乳酸,转化率达到 1.97 mol/mol 葡萄糖[17]。赵锦芳等将来源于乳酸片球菌 pediococcusacidilactici 的 l-乳酸脱氢酶基因导入到大肠杆菌内,构建了工程菌jh12。该菌以6%的木糖为唯一碳源,36 h葡萄糖的消耗速率为 0.88 g/(lh),l-乳酸生产强度为0.60 g/(lh),l-乳酸的产量达到34.73 g/l,纯度达到 98%[18] 。田康明等分别从凝结芽胞杆菌b. coagulans cicim b1821和大肠杆菌 e. coli cicim b0013 中克隆l-乳酸脱氢酶基因bcoaldh 和d-乳酸脱氢酶基因(ldha) 的启动子片段 pldha。将两条 dna 片段连接组成了表达盒 pldha-bcoaldh。将该表达盒通过同源重组删除原始的以fmn为辅酶的l-乳酸脱氢酶编码基因,转入ldha 基因缺失菌株e. coli cicim b0013-080c (ack-pta pps pflbdld poxb adhe frda ldha)的染色体上,获得了l-乳酸高产菌株e. coli cicim b0013-090b。发酵27 h后,l-乳酸产量达到132.4 g/l,产酸强度达到4.90 g/(lh),l-乳酸的得率为0.94 g/g甘油,l-乳酸的光学纯度达到99.95%[19] 。面临着地球的化石能源资源不可避免地逐渐枯竭,利用可再生的碳水化合物通过生物加工生产平台化合物越来越具有吸引力。大肠杆菌的遗传背景清楚,便于遗传改造,同时其对营养成分需求较低,已经成为生产有价值的化学品的平台微生物。通过代谢工程策略获得的理性改造的大肠杆菌菌株,为生物法高效生产众多高价值的化学结构单元提供了新方法 [20]

[1] liu h, kang j, qi q, et al. production of lactate in escherichia coli by redox regulation genetically and physiologically. appl biochem biotechnol, 2011, 164 (2): 162-169.

[2] zhao jf, xu ly, wang yz, et al. production of l-lactic acid from pentose by a geneticall yengineered escherichia coli. acta microbiol sin, 2013, 53(4): 328-337 (in chinese). 赵锦芳, 许丽媛, 王永泽等. 利用五碳糖产高纯度l-乳酸的大肠杆菌基因工程菌的构建. 微生物学报, 2013, 53(4): 328337.

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3. 研究的基本内容与计划

建立实验必须的分析方法

木糖、乳酸、琥珀酸、甲酸、乙酸、乙醇的hplc测定;

表达突变盒的构建

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4. 研究创新点

本文主要以敲除多个产杂酸酶基因的大肠杆菌 K12(pflB, ldhA, ackA-pta,frdA)为起始菌株,利用Red 重组系统实现突变基因盒在大肠杆菌基因组中的高效率重组,再利用自身的Xer重组系统实现靶基因突变后选择性标记高效删除。由此获得能利用木糖产L-乳酸的突变菌株且染色体上无抗生素标记痕迹。

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