嗜水气单胞菌NJ-35株luxS基因缺失株的构建及生物学特性分析开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

嗜水气单胞菌(aeromonas hydrophila, ah)是重要的水生病原菌，给水产养殖业造成极大的经济损失，同时还是重要的人畜共患病病原菌。

该菌的致病性与其产生的毒力因子密切相关，已知毒力因子有胞外酶、溶血素、肠毒素以及粘附素如菌毛和表面蛋白s层等[1]。

这些毒力因子相互协同作用于机体，发挥毒性作用。

2. 研究的基本内容和问题

2.1研究目标：构建嗜水气单胞菌nj-35株luxs基因的缺失株与互补株，对nj-35野生株、缺失株及互补株的生物学特性进行研究，探索luxs基因缺失对密度感应系统、crispr-cas系统调控的影响，为进一步阐明嗜水气单胞菌的致病机理打下基础。

2.2研究内容：2.2.1 构建嗜水气单胞菌nj-35株luxs基因缺失株2.2.2 构建嗜水气单胞菌nj-35株luxs基因互补株2.2.3 嗜水气单胞菌nj-35株luxs基因缺失株及互补株生物学特性分析及比较。

2.3拟解决的关键问题：探索嗜水气单胞菌nj-35株luxs基因缺失后对密度感应系统的影响以及对crispr-cas系统的调控，为探究嗜水气单胞菌nj-35的致病机理打下基础。

3. 研究的方法与方案

3.1.1 构建嗜水气单胞菌nj-35株luxs基因缺失株（1）以菌株nj-35的基因组dna为模板，分别扩增目的基因的上游和下游同源臂序列，然后通过重叠融合pcr将上下游序列融合成一个片段。

（2）通过常规的酶切、连接、转化及pcr鉴定，将融合片段连接到质粒pyak1上。

（3）以含有基因敲除质粒的大肠杆菌sm10为供体菌，以嗜水气单胞菌nj-35为受体菌，进行细菌的接合，筛选出单交换菌株，鉴定后进行第二次同源重组，筛选出基因缺失株。

4. 研究创新点

研究基因功能最常用的方法是缺失，AI-2作为一种通用信号分子的假说提出以后，许多科研工作者构建了luxS基因的缺失株，以期发现luxS/ AI-2对细菌毒力的调控机理，进而针对该系统研制广谱抗细菌药物。

而AI-1对嗜水气单胞菌毒力因子的调控已经有报道，而对于LuxS基因在嗜水气单胞菌中的功能，以及它在QS系统中扮演的角色还知之甚少，所以本课题具有一定特色。

5. 研究计划与进展

5.1研究计划2017年9月-2017年11月，通过pcr及常规的酶切、连接、转化及pcr鉴定、接合等手段，得到嗜水气单胞菌nj-35株luxs基因的缺失株及互补株。

2017年12月-2018年1月，检测嗜水气单胞菌nj-35野生株、luxs基因缺失株及互补株的生物学特性，包括生长曲线、生物被膜形成能力以及检测qs系统基因的表达。

5.2 预期进展随着分子生物学的发展，越来越多的毒力基因从嗜水气单胞菌中筛选出来，研究后发现，许多毒力基因与嗜水气单胞菌的致病性相关。