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1. 研究目的与意义、国内外研究现状(文献综述)
1.课题研究背景和意义
大豆蛋白堪称植物性蛋白中蛋白含量最高且生物效价较好的蛋白质[1],具有突出的营养价值和加工功能特性,被广泛应用于食品工业[2]。豆浆是大豆经过浸泡、磨浆、浆渣分离等工序制成的乳状液[3],其蛋白质消化率在豆制品中是最高的(约95%),因此也是国内外人们从大豆中获取营养最常见的方式之一[4]。近十年来,基于体外消化模型所开展有关食品的研究已有80多项,其中有关大豆蛋白的体外模拟消化研究主要还是停留在静态模拟消化层面,动态模拟消化体系在食源性蛋白的应用集中在动物蛋白,如牛乳蛋白,在大豆蛋白方面的研究少之又少,大豆蛋白在动态模拟消化条件下的变化并不十分清楚,因此这也可作为体外模拟消化系统在食物中应用方面的一个突破口,研究大豆蛋白在动态模拟消化系统里的消化变化。另外,静态系统只能按照酶底物比进行调配,而动态消化系统能够通过改变加样量模拟不同的饱腹程度,从而研究不同饱腹程度对豆乳蛋白消化的作用这一优势很少有人涉及。因此,以豆浆中的豆乳蛋白作为研究对象,比较几种不同的体外模拟消化体系对豆乳蛋白消化的影响具有良好的现实意义。不仅可以动静态体外模拟消化系统的改进提供一定的理论支撑,同时也有助于科研工作者对体外模拟消化系统的选择提供参考,为豆浆豆乳蛋白生物利用率的提高赋予了理论基础。2. 国内外研究概况近年来,体外模拟消化系统愈加受到科研工作者的青睐,基于体外消化模型开展的有关食品的研究也成为热点。2.1静态体外模拟消化系统在大豆蛋白消化中已有的应用于立梅等[5]采用体外静态模拟消化的方法对野生毛豆蛋白的消化率做了研究发现山毛豆的蛋白质含量较高,但体外消化率不如大豆;崔亚丽等[1]采用体外静态模拟消化的方法对颗粒度对豆浆中蛋白质的消化率的影响进行研究,发现未脱皮湿豆豆浆和脱皮湿豆豆浆的蛋白吸收率显著高于未脱皮干豆豆浆和脱皮干豆豆浆;王中江等[6]采用体外静态模拟消化对热处理大豆蛋白体外消化产物结构特征进行分析发现,过度的加热也会引起蛋白的聚集。2.2动态体外模拟消化系统在食源性蛋白消化中已有的应用ménard等[7]采用动态模拟消化体系研究了婴儿配方食品中蛋白质的水解动力学, 同时与小猪体内消化的真实情况进行比较,结果显示乳球蛋白和酪蛋白在体内和体外消化的相关性达 0.987(p 0.001)。wilde等[8]采用最新开发的半动态成人体外模型对以下样品进行了其胃行为方面的研究:经过15 s 72℃巴氏灭菌或3 s 140℃超高温(uht)处理且均被中试规模均化处理后的全脂牛奶。han等[9]使用体外动态胃消化模型-人体胃模拟器(hgs)和肠道模型研究了乳蛋白稳定的水包油乳剂的胃行为对肠道脂质消化的影响。ménard等[10]测定可饮用酸奶的粘度和成分对胃排空与动态体外消化的影响。keller等[11]通过算机可控的小肠体外动态模型(tim-1)评估了凝结芽孢杆菌gbi-30,6086能帮助消化植物蛋白的蛋白质消化的潜力。2.3不同体外模拟消化系统之间在食品中已有的对比研究
eggera等[12]采用动态didgi系统和静态协调的infogest系统对脱脂奶粉中存在的主要乳蛋白的消化水解进行研究,发现体外动态模拟系统中蛋白质水解的动力学,特别是在胃相期间faa的释放,更接近体内情况。 manzini等[13]分别利用静态消化模拟体系和动态模拟体系评价了小麦面包中真菌毒素白僵菌素和恩镰孢菌素的生物可及性,结果显示经动态模拟体系消化后测得的毒素水平要高于静态模拟消化体系消化后得到的结果。wiele等[14]将5 种体外消化模拟体系中铅的生物可及性情况与体内消化情况进行比较。综上所述,在当前研究中静态消化模拟体系在食品中的应用涉猎面较广,相比之下,动态体外模拟消化体系所涉及的面较窄,其在食源性蛋白的应用主要还是集中在动物蛋白方面,如牛乳蛋白;而大豆蛋白在动态模拟消化条件下的变化并不十分清楚 。3. 应用前景随着研究发展,对健康和安全的关注已不再是饮食中利害成分的简单评估,而是对各成分协同拮抗作用的研究,以及更为重要的利害成分在人体内复杂的生物利用。在我国,利用体外消化对食物和药物生物利用、毒理药理、安全评价研究的需求不断提高[15],通过比较不同模拟消化体系对豆乳蛋白消化的影响,获得不同模拟消化体系下有关豆乳蛋白消化的基础数据,有助于全面了解豆浆营养成分在人体消化吸收过程中的变化,为优化豆浆或获得高品质豆制品提供理论和技术参考的依据,同时也为检验仿生消化系统的模拟效果,为进一步完善和使用体外模拟消化系统提供参考。另外加强体外人胃肠模拟系统的基础与应用研究将会在食物代谢动力学、食品中药物残留安全性评价、 营养物质生物利用率评估等方面发挥更大、更积极的贡献[16]。[1] 崔亚丽. 颗粒度对豆浆品质及蛋白质消化率的影响 [d].西北农林科技大学, 2012.[2] 周志红, 唐传核, 杨晓泉. 大豆蛋白的体外模拟消化过程及热处理的影响 [j]. 食品科学, 2006, 01:37-40.[3] cruz n s, capellas m, jaramillo d p, et al. soymilk treated by ultra high-pressure homogenization: acid coagulation properties and characteristics of a soy-yogurt product [j]. food hydrocolloids, 2009, 23(2): 490-496.[4] 林旭东, 潘巨忠, 凌建刚. 豆浆的保健功能及研究进展 [j]. 现代农业科技, 2007, 24: 146-155.[5] 于立梅, 于新, 曾晓房, et al. 野生山毛豆蛋白制备及体外消化模拟研究 [j]. 食品科学, 2010, 31(13): 60-64.[6] 王中江, 张潇元, 隋晓楠, et al. 热处理大豆蛋白体外消化产物结构特征分析 [j]. 食品科学, 2017, 38(01): 20-26.[7] menard o, cattenoz t, guillemin h, et al. validation of a new in vitro dynamic system to simulate infant digestion [j]. food chemistry, 2014, 145:1039-1045.[8] mulet-cabero a-i, mackie a r, wilde p j, et al. structural mechanism and kinetics of in vitro gastric digestion are affected by process-induced changes in bovine milk [j]. food hydrocolloids, 2019, 86:172-183.[9] wang x, lin q, ye a, et al. flocculation of oil-in-water emulsions stabilised by milk protein ingredients under gastric conditions: impact on in vitro intestinal lipid digestion [j]. food hydrocolloids, 2019, 88:272-282.[10] menard o, famelart m h, deglaire a, et al. gastric emptying and dynamic in vitro digestion of drinkable yogurts: effect of viscosity and composition [j]. nutrients, 2018, 10(9):38-51.[11] keller d, van dinter r, cash h, et al. bacillus coagulans gbi-30, 6086 increases plant protein digestion in a dynamic, computer-controlled in vitro model of the small intestine (tim-1) [j]. beneficial microbes, 2017, 8(3):491-496.[12] egger l, m nard o, baumann c, et al. digestion of milk proteins: comparing static and dynamic in vitro digestion systems with in vivo data [j]. food research international, 2017,12:49-57.[13] manzini m, rodriguez-estrada m t, meca g, et al. reduction of beauvericin and enniatins bioaccessibility by prebiotic compounds, evaluated in static and dynamic simulated gastrointestinal digestion [j]. food control, 2015, 47:203-211.[14] van de wiele t r, oomen a g, wragg j, et al. comparison of five in vitro digestion models to in vivo experimental results: lead bioaccessibility in the human gastrointestinal tract [j]. journal of environmental science and health part a, toxic/hazardous substances environmental engineering, 2007, 42(9):1203-1211.[15] 龚凌霄, 曹文燕, 王静, et al. 动态智能人体消化模拟体系及其在食品研究领域中的应用 [j]. 中国食品学报, 2018, 18(10):258-268.[16] 李玉珍, 肖怀秋, 姜明姣, et al. 体外人胃肠模拟系统在食物消化行为研究中的应用进展 [j]. 中国酿造, 2017, 36(07):153-156.
2. 研究的基本内容和问题
1研究目标
分别采用体外静态模拟消化系统、体外动态饱腹模拟消化体系(加样量6 ml)、体外动态半饱腹模拟消化体系(加样量3 ml)、体外动态微饱腹模拟消化体系(加样量1 ml)四种不同模拟消化体系对豆浆进行模拟消化,检测豆浆在不同的消化时间点时各项基础指标的变化,探究在不同消化体系下豆乳蛋白营养成分的变化及其差异,为全面了解豆浆营养成分消化吸收过程提供理论基础,同时为检验仿生消化系统的模拟效果提供参考,促进体外模拟消化系统的改进与完善。
2研究内容
3. 研究的方法与方案
1研究方法
体外静态消化模拟体系:参考Minekus(2014)[1]及Xing(2017)[2] 。
体外动态消化模拟体系:DIVRSD-Ⅱplus体外仿生大鼠胃肠道系统[3]
可溶性蛋白含量的测定:Bradford法(考马斯亮蓝法),参考Bradford(1976)[4]。
肽含量的测定:OPA法,参考Rui(2016) [5]。
蛋白分子量分布情况的测定:SDS-PAGE法(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳),参考Huang(2019) [6]。
免疫反应性的测定:Elisa法,使用市售蛋白特异性酶联免疫吸附测定试剂盒,参考Xing(2019)[7]。
粒径大小的测定:粒度分析仪,参考Xing(2019) [7]。
数据分析统计:Excel和IBM SPSS
参考文献:
[1] MINEKUS M, ALMINGER M, ALVITO P, et al. Astandardised static in vitro digestion method suitable for food - aninternational consensus [J]. Food function, 2014, 5(6):1113-1124.
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2技术路线(见附件)
3实验方案
①制备豆浆。
黄豆浸泡过夜,以豆水比1:9的比例打浆、滤过豆渣、95℃煮沸5 min后制得豆浆样品。
②配制模拟消化液。
Ⅰ.模拟口腔消化液的配制方法(以终浓度计):15.1 mmol/L KH2PO4,3.7 mmol/L KCl,13.6 mmol/L NaHCO3,0.15 mmol/L MgCl2(H20)6,0.06 mmol/L (NH4)2CO3;用1 mol/L HCl/NaOH将pH调至7.0,于37℃水浴锅20 min后备用
Ⅱ.模拟胃消化液的配制方法(以终浓度计):0.27 g/L胃蛋白酶,1.5 g/L胃粘液素,0.9 mmol/L KH2PO4,6.9 mmol/L KCl,25 mmol/L NaHCO3,47.2 mmol/L NaCl,0.1 mmol/L MgCl2(H20)6,0.5 mmol/L (NH4)2CO3;用1 mol/L HCl将pH调至1.6,于37℃水浴锅20 min后备用
Ⅲ. 模拟肠消化液的配制方法(以终浓度计):8.17 g/L胆盐,5.62g/L胰液素,0.8 mmol/L KH2PO4,6.8 mmol/L KCl,85 mmol/L NaHCO3,38.4 mmol/L NaCl,0.33 mmol/L MgCl2(H20)6;用1 mol/L NaOH将pH调至7.0,于37℃水浴锅20 min后备用
③ 口腔消化阶段。
豆浆样品按1:1的比例在简单容器中与模拟唾液缓冲液混合,置于37℃55 rpm振荡2min,以模拟口腔消化
④静态胃肠消化。
胃消化阶段,将样品胃蛋白酶(0.27 g/L)-胃粘液素(1.5 g/L)模拟胃液pH值调至1.6后按照1:1的比例加入口腔食糜,37℃,55 rpm的条件下反应2h;
肠消化阶段:胃消化2h后再次按照1.:1的比例加入胆盐(8.17g/L)-胰液素(5.62 g/L)模拟肠液,放入37℃摇床以150 rpm摇速震荡样品2h,模拟人体小肠消化过程。
⑤动态胃肠消化。
打开DIVRSD-Ⅱ plus体外仿生大鼠胃系统,调节温度至37℃。设置设备运行参数:模拟胃液注入速度52 uL/min;模拟肠液注入速度52 uL/min;胃消化食糜排空速度70 uL/min(肠消化食糜排空速度120 uL/min);胃挤压频率为3 cpm,胃滚动频率为12 cpm,肠滚动频率为36 cpm。
在鼠胃模型中依次注入0.6 mL模拟胃液以及6 mL(饱腹状态)/3 mL(半饱腹状态)/1 mL(微饱腹状态)豆浆口腔食糜后,开始消化,按时间点定时取样。取样后采用沸水浴5min终止样品中的酶消化反应。
⑥取样:整个消化过程共取8次样,如下:豆浆样品原液P0;结束2 min口腔消化后取样P1;胃消化5 min,30 min,60 min取样P2-5,P2-30,P2-60;肠消化5min,30 min,120 min取样P3-5,P3-30,3-120。取样后立刻采用沸水浴5min终止样品中的酶消化反应。
⑦各指标的测定。
对各个取样点样品的基础指标进行测定,包括可溶性蛋白含量、肽含量、蛋白分子量分布情况、免疫反应性、粒径大小等指标
4可行性分析
4.1理论可行性分析
指导老师芮昕老师的研究方向为蛋白营养与功能,在豆类蛋白营养解析及模拟人体消化对豆类蛋白及功能成分转化方面开展了深入研究,积累了丰富的经验,在她的指导下,将有助于实验的顺利进行并取得预想的成果。
另外,通过查阅大量与本课题有关的专业文献资料发现,此课题完全符合理论上的可行性。
4.2实验可行性分析
本课题研究已具备所需实验材料、指导老师及相关的理论依据,,并且本人已具备实验所需的实验操作基础及实习基础。
4. 研究创新点
1. 特色或创新之处
一方面,人胃肠道模拟系统从最初的静态短暂模拟到当前的动态多相连续模拟,系统的种类越来越多,系统的真实性、仿真性和安全性越来越高,其在食品消化行为中的应用也越来越广。然而,有关不同模拟消化体系之间的对比研究也是寥寥无几;另一方面,在当前研究中不难发现静态消化模拟体系在食品中的应用涉猎面较广,相比之下,动态体外模拟消化体系所涉及的面就显得较窄,其在食源性蛋白的应用主要还是集中在动物蛋白方面,如牛乳蛋白;而大豆蛋白在动态模拟消化条件下的变化并不十分清楚,因此本课题采用四种不同的体外模拟消化体系:体外静态模拟消化系统、体外动态饱腹模拟消化体系(加样量6 ml)、体外动态半饱腹模拟消化体系(加样量3 ml)、体外动态微饱腹模拟消化体系(加样量1 ml),以豆浆为样品,研究大豆蛋白在不同模拟消化系统里的消化变化和差异。通过收集不同体系下豆乳蛋白的消化数据,有助于全面了解豆浆营养成分在人体消化过程中的变化,同时也为优化完善体外模拟消化体系提供了一些依据。
另外,与动态体外消化系统相比,静态体外模拟消化系统只能通过改变酶底物比来模拟不同的饱腹程度,然而动态系统却可以直接通过改变加样量等方法直接模拟不同的饱腹程度对消化的作用,至今为止这一方面很少有研究者涉及,因此本课题利用动态消化系统这一优势设置了三组体外动态模拟消化体系,拟以体外静态模拟消化系统为对照,探究静态消化体系与动态消化体系,以及三组动态消化体系在影响豆乳蛋白消化特性之间的差异。
5. 研究计划与进展
1 研究计划及进展
课题拟从2018年10月开始到2019年4月完成。
2018年10月-2018年11月
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