生长素在豌豆复叶形态建成中的作用外文翻译资料

生长素在豌豆复叶形态建成中的作用

原文作者 Darleen A. DeMason·Rekha Chawla

摘要：本研究的目的是探索植物生长素对豌豆复叶形成的影响。野生型（WT）植株以及两个叶突变型植株，即豌豆（豌豆属）的tl型与uni-tac型，都生长在含有生长素传送抑制剂2，3，5-三碘苯甲酸（TIBA），N-（1-萘-乙基）邻氨甲酰苯甲酸（NPA），或生长素拮抗剂对氯苯氧异丁酸（PCIB）的培养基上。通过扫描电子显微镜对得到的植株的形态进行仔细的分析。相关Uni基因的表达出现在一系列叶型突变体的茎尖中。通过对所有基因型进行检查发现都出现了形态学异常。野生型植株的终端卷须转化变嫩叶，残端或被中止。在叶片上产生的羽状叶的数目减少，且在近端形态消失之前，远端形态先被淘汰。一些叶片转变成简单的形式，包括三叶形或双叶形。在最极端的情况下，叶片完全消失只剩下一对托叶或鳞片叶。生长素极性运输对所有叶片部分而言是由上自下的运输。用60mu;M NPA和TIBA处理时，Uni基因在茎尖中的表达显著减少。与野生型植株相比，Uni mRNA在tl，af和af tl中更丰富，在uni突变体中减少。这些结果显示生长素梯度在豌豆复叶形态建成的调控中起基础性的作用。具体来说：(i)它是叶片生长的驱动力，是羽状叶片的决定因素；(ii)它是羽片叶启动的必要条件；(iii)它控制后续羽片叶的生成。

关键词：生长素运输；复叶；叶片形态；突变体豌豆；豌豆；单叶

引言

豌豆的成年野生型营养叶为羽状复叶，在它们的基部拥有一对不对称的复杂的托叶，一个明显的叶柄和一个由两到三对卵形的异面叶和两到三对简单卷须和一个顶生的简单卷须组成的叶片。不仅这类侧向附属器官有明显的极性，而且横向尺寸/质量也从基部到顶端逐渐减小（Lu等）。Marx（1987）依据已知的单个基因和似乎只影响单个区域的隐性突变类型将野生型豌豆分为三个区域，分别为基底托叶、近端小叶和远端卷须。

在豌豆中有很多叶型突变体的为小叶取代卷须型（tl）和半无叶型（af）。在tl植物上成年叶有五到六对侧生小叶和一片顶生小叶。成年的af叶片在近端区域有两到三对分叉的卷须，在远端区域有两到三对简单的卷须和一个简单的顶生卷须。正如Marx(1987)认为，尽管这些突变体表型的出现似乎仅影响一个单一区域如af似乎只影响近端/小叶区域，tl似乎只影响远端/卷须区域，但经过对5个杂交组合进行仔细形态学和解剖学分析证明基因交互影响沿叶轴所有位置上的羽状叶和其他叶形的发育。然而，每个基因的影响强度取决于叶片的部位，Af在叶柄和近端羽叶上有较强的影响，而Tl在远端和顶生羽叶上有较强影响效果（Villani and DeMason 2001）。

另外，充分表征uni和tac（uni-tac）是影响豌豆叶形态的单基因突变体。这些突变体的叶上有顶生小叶。在顶生小叶和最远侧叶片之间有较少的侧生小叶和较多的交错。尽管较少出现两对羽叶，但成年uni叶通常是单叶的，双叶或者三叶的(Lamprecht 1933; DeMason and Schmidt 2001)。除了顶生小叶，成年叶有两到三对近端叶，没有或有一对远端卷须(Sharma 1972; Marx 1987; DeMason and Schmidt 2001)。uni突变体是不育的，有花序和花的异常(Lamprecht 1933),但uni-tac突变体通常有正常的可育的花（Sharma 1972)。通过对uni基因和三个突变体等位基因测序，发现这个基因是多叶拟南芥的同源基因(Hofer et al. 1997; DeMason and Schmidt 2001)。

经过详细的观察形态学特征并对叶的发育进行比较发现WT, uni-tac and uni的叶在叶的大小，侧生羽叶对的和类型上存在一个连续的范围，uni-tac在这些特点中处于中间地位， uni和uni-tac叶上的侧生羽片对与野生型植株上最近端的羽片对相对应，突变体上的顶生小叶对应于野生型植株上缺失了的远端侧生羽片对。顶生羽片的早熟导致uni-tac和uni的器官形成期缩短(DeMason and Schmidt 2001)。uni-tac和uni植株具有正常的托叶，其叶柄和近端羽片叶的大小也与野生植株的叶片相似。然而突变体叶的尖端却受到了最强烈的影响。这些发现证明形态发生素梯度控制豌豆叶的发育，而且Af，Tl，Uni和其他可能决定叶形态的基因在这个梯度内受到形态发生素浓度的调控。

由于生长素以一种明显的由上而下的方式在茎中运输，所以植物发育的极性往往与生长素影响有关。生长素在很多生长进程中扮演着信号或传递位置信息的形态发生素的角色(Uggla等1996; Sabatini 等1999; Scheres 2000; Friml等2002;Friml 2003)。尽管曾经没有人提出生长素在复合叶植物的叶片发育中起着调节作用，但现存的证据证明生长素的运输在豌豆叶的生长发育中有着重要的影响。Gould 等(1991)在不同浓度的生长素抑制剂TIBA中利用WT，af，tl基因型种子的腋芽培养出幼苗，结果发现诱导出大量异常叶片。经过验证得出四种常见的异常叶为：代替复合叶的单叶，代替顶生卷须的顶生小叶，最远端横向和顶生羽片之间的联合体。所有这些异常也是uni突变体叶的特征。因此，无论是破坏uni基因的活性，还是中断生长素的运输从而干预豌豆正常叶的发育，似乎都会产生相似的表型。

尽管Gould等人(1991)不相信由于TIBA的处理导致生长素梯度的破坏是异常叶产生的原因，但他们假设了如果生长素梯度存在，那它就是从芽顶端分生组织产生，然后运输至叶片上。目前，还没有数据证明生长素在叶的发育过程中是向上运输还是向下运输。这项研究有必要进行扩展再调查。

在Gould等人 (1991)最初研究的基础上，本研究试图通过收集生长素抑制带来影响的数据，使用扫描电子显微镜观察早期叶片的发育情况，从而达到能够确定生长素运输方向的目的。在本研究中所涉及到的问题有：(i)对每个具有基因型为WT，tl，和uni-tac的叶片而言，生长素抑制剂对其发育有什么具体影响？(ii)在幼嫩，展开的豌豆叶中，生长素运输的方式是什么？

材料与方法

1.植物材料

这个研究的所有实验线路都是由Marx收集，并由Claire Coyne博士策划。

uni-tac材料是W6 15272 (Marx line 255)。Uni材料从W6 15302 (Marx line 287; DeMason 和Schmidt 2001)中分离出来。其他材料来自G. Marx构造的一系列近等基因系，且被命名为Af St Tl (野生型) W6 22593, Af St tl W6 22594，af St Tl W6 22597 和 af St tl W6 22598。

2.组织培养与形态学观察

组织培养系统由Gould 等(1987, 1991)开发，在本实验使用的过程中对其做了一些修改。

将表面消毒的种子放在含有MS盐的培养基上培养7-9天，用Magenta盒（每盒5-6颗种子）培养或用培养试管单独培养。从第一片真叶上取节点外植体，分别转移至含25ml培养基（培养基中有MS无机盐，3%的蔗糖和3.3mu;M的BAP）的培养管中，培养7天。然后将外植体转移至不含BAP的相同培养基中另外培养5周，直到腋芽/幼苗生长出来。Gould 等(1991)指出BAP对叶的形态没有影响。种子和植株在标准培养室中生长，荧光照明（光照强度30-42mu;mol.m^-2 .s^-1，16小时的光周期）。所使用的抑制剂为NPA，TIBA和PCIB。

共培养6天后，将植株从培养试管中取出，然后在解剖镜下分别进行观察。在每个植株上可观察到叶片的数目，在每片叶上可观察到羽片叶的数目，将每个基因型的顶生羽片的类型记录下来。另外，记录沿叶轴每个节点的羽片形态 （羽片1为最基本的形态）。各处理的样品大小为15棵植株。

3.扫描电子显微镜

野生型植株在上述组织培养中产生，不同之处是外植体在含有BAP的培养基上生长2.5周。将得到的外植体（大约长有7个叶原基）的茎尖切除并固定在含有4%的福尔马林和5%的乙酸，40%的乙醇混合液中，在4℃下放置2-3天。然后将它们脱水，对干燥茎尖进行解剖，并放于扫描电子显微镜下观察。

4.生长素转运

用于本实验的野生型植株生长在标准温室中，实验实施的情况与Okada 等(1991)描述的基本一致。将长约2cm的叶片部分从成年展开的叶片上切掉，然后以直立和倒置的方向放在1.5ml的离心管中。在这些离心管中加入40mu;l的0.5times;无机MS培养基，培养基含有1.45mu;M的IAA。在室温下培养18h，然后将叶片放在介质中漂洗几次，吸干水分，切成两半。将上半部分称重，并放在闪烁剂中，结合的放射剂的量用Beckman LS3801液体闪烁计数器来测量。

结果

1.生长在对照培养基上的植株的形态学观察

外植体在节间部分有幼苗节点，出现三个大小不同的腋芽，在这种培养条件下，其中一个外植体成长为植株。豌豆幼苗在培养6周后，在大小方面发生变化，产生大量的叶片。愈伤组织在植株的基部形成，且通常没有诱导产生根。与在温室种植的豌豆的基础节点部位的腋芽相比，这些植株非常小。野生植株在没有抑制剂的情况下（对照组）平均产生8片展开叶，较少植株产生花或花蕾。在上方节点的叶片通常具有两到三对羽片叶和一个顶生的卷须。

2.抑制剂对组培苗叶片和芽形态的影响

在两个生长素转运抑制剂NPA和TIBA上生长的野生型植株上发现有相似的叶型异常。节间缩短与叶柄横向膨胀及托叶的减少和小叶的伸展都是抑制剂常见的反应。在抑制剂的三种浓度中生长，植株都发生了异常。但发生的频率和严重程度一般都随着抑制剂浓度的增加而增加。

抑制剂影响叶片的大小，影响的强度因节点，抑制剂和基因型的不同而产生差异。生长在对照培养基上的野生型植株通常在节点1有一对复叶，在节点2和3羽片对的数目增加，在节点4趋于平稳。与对照组植株相比，野生型植株在加有NPA抑制剂的培养基上进行生长，平均每棵植株总的叶片数量下降，且叶片上羽片对的数目叶减少。生长在60mu;M NPA的植株在平均产生5片叶后停止生长，那些生长在30和15mu;M的植株在分别长出6和7片叶的时候停止生长。在节点3和4上羽叶对的数目减少的最严重。生长在对照培养基上的tl植株在节点4及以上节点处显示有异型胚芽的增长。在加有NPA的培养基上生长的每棵植株上几乎都产生许多的叶片，但是每片叶上产生的小叶对持续减少。这种情况在每个节点都会产生，但在节点3-5最为严重。生长在对照培养基上的Uni-tac植株在节点3产生的叶片带有1-1.5个羽叶对，达到高峰。与对照组的相比，生长在三种NPA浓度的uni-tac植株在节点3和4上的叶片生长有较少的羽叶对。生长在60mu;M 的NPA上的植株平均仅产生4片叶，那些生长在15和30mu;M浓度的NPA上的植株的叶片在节点5比对照组拥有更少的羽叶对。

生长在TIBA上的野生型植株通常在节点4或5后停止产生叶片，并且在节点3-5上的叶片产生更少的羽叶对。在相同浓度下，TIBA与NPA相比会产生相似但更严重的影响。生长在PCIB上的野生型植株平均会产生四片叶（25mu;M），五片叶（50mu;M）或六片叶（25mu;M），但是对照组植株通常会产生七片叶。在节点4及其以上部位，叶片上羽叶对的数目会减少。

3.在展开的豌豆叶片中生长素运输的方向

用标准方法测定生长素的极性运输(Okada等1991)，我们无法对整个发育中的复叶豌豆的生长素运输获得一致的结果。代替这一点，我们将展开的成年叶片分割成合适的大小，以保证能够放在微量离心管底部培养基中。用这种方法测量叶片的五个部分，发现基部的生长素运输比顶部的多。基部运输对NPA抑制剂比较敏感，但顶部除了嫩叶外对NPA不敏感。这种情况可能是生长素并不是严格按照向顶部或向基部运输的方向进行的，而是从边缘向内部发生的(Mattsson等1999, 2003; Sieburth 1999; Aloni等 2003)。

参考文献

Aloni R, Schwalm K, Langhans M, Ullrich CI (2003) Gradual shifts in sites of free-auxin

production during leaf-primordium development and their role in vascular differentiation and

leaf morphogenesis in Arabidopsis. Planta 216:841–852

Blazquez MA (2000) Flower development pathways. J Cell Sci 113:3547–3548

Blazquez MA, Weigel

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