虎眼万年青糖基转移酶基因克隆及功能鉴定文献综述

一、课题研究背景、目的及意义：

自然界中有着多种多样的植物，它们中很大一部分具有药用价值，是人类研究天然药物的重要来源。但是，人类已知的一些具有药物活性的天然产物，其含量却极其稀少，亦或是在人类进行大规模提取的过程中，常常使其活性丧失。本次实验的初衷便是希望通过使用生物学技术，将糖基转移酶基因进行大规模扩增，与相应克隆及表达载体进行连接，并诱导表达得到相应产物。再对该产物进行分离、纯化及功能鉴定，从而获得所需糖基转移酶。植物糖基转移酶的鉴定工作将会在未来几年取得重大进展[1]。

糖基转移酶（GT）是能够催化糖基从激活的供体转移到特定的受体分子上的一类酶，在

生物体中普遍存在。植物糖基转移酶所催化的糖基化反应通常是将UDP-葡萄糖等糖基供体转移到激素、次级代谢产物等一系列小分子化合物受体上[2-4]。糖基化会改变植物小分子化合物的生物活性、水溶性、稳定性。应用在药学领域，可有效增加一些脂溶性药物的极性，从而改善其水溶性，利于吸收及药效释放。[5]

按照所催化的底物的性质和序列相关性, 生物界存在的糖基转移酶被划分成90多个不同的家族。其中家族1(family 1)包含的成员数量最多, 与植物的关系最密切。[6-7]这个家族中的酶所催化的底物是一些亲脂性的小分子化合物, 一个或多个糖基可以结合在这些分子的-OH、-COOH、-NH2、-SH 或C-C 基团上。家族1中, 有些酶在C端具有一个由44个氨基酸组成的保守序列, 这一保守序列称C 末端保守区或PSPG盒(plant secondary product glycosyltransferasebox)或特征基序(signature motif)。在家族1 中具有C 末端保守区的酶占48% 左右, 推测这一保守序列可能在糖基化过程中与尿嘧啶核苷二磷酸-糖(UDP-sugar)的结合有关。这些酶的N 端序列变异较大, 与不同底物的识别有关。[8-10]

糖基转移酶的底物包括糖基供体和糖基受体。通常我们把含有糖苷键的一方或者说含有参加反应的端基异头碳的一方称为糖基供体，而与之反应的另一方称为糖基受体。糖基供体通常为核苷糖。按照酶催化机制，糖基转移酶可以分为两种类型，保留型（retaining，R）和反转型（inverting，I），这种分类是从立体化学水上来认定的，糖基供体上的活性糖基的异头碳有一定构型,当糖残基转到受体上，异头碳构型没有改变，该过程中对应的糖基转移酶，即为保留型，反之如果发生反转，对应酶则为反转型[11-12、14]。GT-1家族的糖基转移酶按照催化机制分为反转型。所以在利用该家族的糖基转移酶进行催化反应时，应注意供体糖端基异头碳构型的选择。[2]虽然UDP-糖是植物的家族1糖基转移酶最常用的核苷糖, 但在单糖的种类中, 这类酶却有不同的选择。其中, UDP-葡萄糖是最常用的糖供体, 除此以外, 家族1 中有些酶以UDP- 鼠李糖(UDP-Rha)、UDP- 半乳糖(UDP-Gal)、UDP-木糖(UDP-Xyl)以及UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcUA)作为专一性的糖供体。[13]

目前，鉴定糖基转移酶的方法主要有三种：(1)传统生物化学方法，这种方法是早期研究者所采用的方法，主要过程包括分离提取活性酶蛋白，然后研究该酶的底物特异性和酶的

动力学特征。通过该方法可以区分一些糖基转移酶，并揭示其部分特征。但该方法过于繁琐且耗时，对于研究超基因家族来说工作量过大；(2)分子生物学方法，主要采用的技术就是分子克隆，通过构建cDNA文库，然后利用已有的糖基转移酶基因设计的探针，从文库中筛选出可能的糖基转移酶基因。这一方法是目前通过实验来确定糖基转移酶基因的常规方法，研究者可以从这些实验数据中获得更多糖基转移酶的表达特征；(3)生物信息学方法。主要通过使用同源搜索工具BLAST或FASTA等从目的物种的cDNA或EST数据库中获取可能的糖基转移酶基因序列，接下来就可以对该基因进行克隆来进一步确认。Kikuchi等[15]在2006年的研究中就指出生物

信息学在糖组学的研究中已体现出强大的优势，不仅用于糖基转移酶基因的发现和鉴定，还可以用于目的基因的功能预测、基因结构分析、亚细胞定位；或者对于蛋白质的结构域分析、水性分析、保守序列预测、甚至三维结构的预测等等。本次实验便是通过使用分子生物学方法获得的目的基因进行基因的克隆及后续功能鉴定。