凝结芽孢杆菌半乳糖苷酶的结构分析和分子改造开题报告

 2021-08-08 12:08

1. 研究目的与意义

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase),简称乳糖酶(lactase),普遍存在于动物组织、各种植物以及微生物中,能水解多糖或寡糖中的β-半乳糖苷键,一些β-半乳糖苷酶也能催化转糖基反应生成低聚半乳糖。β-半乳糖苷酶可广泛应用于乳品,食品及分子生物学研究中。凝结芽孢杆菌NL01β-半乳糖苷酶是一种具有优异的水解性能的耐热酶,对乳糖具有优秀的完全水解能力,可以应用于乳糖不耐症的治疗及乳清乳糖的预水解。本实验对半乳糖苷酶的产物抑制进行了研究,产物半乳糖的存在会抑制半乳糖苷酶的活性,导致分解效率大大的降低。目前,国内外对葡萄糖苷酶的产物抑制研究较多,而关于β-半乳糖苷酶的研究很少,基于这一点本实验将利用分子生物学的手段对半乳糖苷酶的结合位点或者催化位点进行定点突变,来解除产物抑制。本论文首先异源表达来源于凝结芽孢杆菌NL01的β-半乳糖苷酶,并结合分子模拟的手段对NL01β-半乳糖苷酶产物抑制的结构基础进行研究。在此基础上通过蛋白理性设计,定点突变对产物抑制予以解除。项目的完成不仅可以为β-半乳糖苷酶产物抑制结构基础研究奠定理论基础,还可为提供新型的工业酶,具有较强的应用价值。

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2. 国内外研究现状分析

国内对于乳糖酶耐高温性质和乳糖酶水解方向的研究较多,但对于β-半乳糖苷酶合产物抑制的研究刚刚起步。这些研究中,结合位点和催化位点单个氨基酸对整个乳糖酶双向性质影响的研究很少。国际上研究也比较少,只有少数科学家在做这方面相关的研究。因此在基于位点变化而影响乳糖酶产物抑制的研究上还有很大的空间。

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3. 研究的基本内容与计划

凝结芽孢杆菌β-半乳糖苷酶突变点的选择。(通过序列比对分析凝结芽孢杆菌β-半乳糖苷酶的氨基酸序列,基于同源建模的3Dg构象确定可能对产物与活性中心结合有影响的氨基酸序列进行定点突变实验)

凝结芽孢杆菌β-半乳糖苷酶突变体的定点突变,外源表达及纯化。(引物设计,PCR产物的酶切及转化,质粒的测序,突变酶的诱导表达及纯酶的获得)

凝结芽孢杆菌β-半乳糖苷酶突变体酶活的测定及动力学分析。(以本体酶为对照,测定半乳糖的抑制常数)。

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4. 研究创新点

在β-半乳糖苷酶水解乳糖过程中,普遍存在产物抑制,特别是半乳糖的竞争性抑制。目前关于其抑制机理及解除手段的研究还较少。本研究考察产物葡萄糖及半乳糖的抑制常数,结合分子模拟的手段对NL01β-半乳糖苷酶产物抑制的结构基础进行研究。在此基础上通过蛋白理性设计,定点突变对产物抑制予以解除。项目的完成不仅可以为β-半乳糖苷酶产物抑制结构基础研究奠定理论基础,还可提供新型的工具酶,具有较强的应用价值。

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