1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
(1) 课题意义
蛋白核小球藻中富含蛋白质、多种必需氨基酸、多不饱和脂肪酸，以及维生素、矿物质、甾醇等生物活性物质，因为这些特性，常被用于饲料（饵料）、化妆品、保健品等领域。如在水产养殖中将蛋白核小球藻细胞作为常用的活体饵料，同时小球藻饵料还可以起到净化水质的作用。为此，微藻在我国有着较大的应用市场，但产量却微乎其微。目前，小球藻的主要生产形式是采用光自养养殖法，存在藻浓度低，产量低，产量和质量不稳定，受户外天气影响大等问题，说通俗点就是“靠天吃饭”。微藻的异养发酵生产法就完全避开了光自养法所存在的问题，因为，微藻发酵法完全在室内的发酵罐内培养微藻。此外，与微藻光自养培养的藻浓度相比，微藻的发酵培养法可以将藻浓度提高到几十倍。
本研究旨在优化蛋白核小球藻高密度发酵培养工艺，以期在获得稳定的发酵培养工艺外，提高藻密度，为小球藻的中式发酵工艺研究及放大培养和工业化生产奠定基础。
2. 研究的基本内容和问题
1. 研究目标
本研究旨在实验室的规模水平上通过对蛋白核小球藻异养培养基的筛选、优化及培养条件的优化，获得一条稳定的蛋白核小球藻异养培养发酵工艺，以期提高藻密度。
2.研究内容
3. 研究的方法与方案
研究方法
蛋白核小球藻藻种的筛选、纯化主要采用平板划线纯化的方法；异养培养基筛选及优化主要采用Plackett-Burman、最陡爬坡以及中心组合实验设计方法；异养培养基C、N、P配比优化采用正交实验设计的方法；异养培养条件的优化采用单因素和正交实验设计的方法。
技术路线
| 藻种的筛选和纯化 |
| 培养基筛选及优化 |
| 培养基C、N、P配比优化 |
|
实验方案
（1）藻种的筛选和优化
无菌蛋白核小球藻藻种是从带菌的微藻中分离纯化得到。本工艺所使用的液体培养基配方见下表，固体培养基为液体培养基补加0.2%琼脂。
表 培养基配方
| 试剂名称 | 配方 |
| NaNO3(mg/L) | 1500 |
| K2HPO4(mg/L) | 39 |
| MgSO4·7H2O(mg/L) | 75 |
| CaCl2·2H2O(mg/L) | 36 |
| Citricacid(mg/L) | 6 |
| 微量元素(mL/L) | 1 |
微量元素的配方为：FeC6H5O7·NH4OH6g/L，Na2EDTA1g/L，MnCl·4H2O1.81g/L，ZnSO4·7H2O 0.222g/L，Na2MoO4·2H2O0.39g/L，CuSO4·5H2O 0.08g/L，
H3BO3 2.86g/L。
将灭菌后的BG-11培养基冷却至50~55℃时，加入终浓度100mg/L头孢霉素、10mg/L多菌灵，倒平板，将蛋白核小球藻和雨生红球藻在培养基划线后密封，放入光照培养室27℃培养，50μmol/m2/s光照培养5d。然后，从仍然有菌落出现的培养基挑取藻再次接种到抗生素培养基中进行第2次纯化，直至没有菌落出现为止。
（2）异养培养基筛选及响应面优化；
异养培养基筛选
采用500mL摇瓶在可控温摇床上进行，500ml摇瓶中装入250ml异养培养基（Endo培养基、改良的Endo培养基和改良的Basal培养基），经121°C灭菌20min，冷却后，按10％比例的接种量接入摇瓶，在无光照、150rpm、30°C的条件下进行异养培养。定期取样测小球藻液在680nm处的吸光度值。
表 Endo培养基、改良的Endo培养基和改良的Basal培养基配方
| 组成成分 | Endo培养基 | 改良的Endo培养基 | 改良的Basal培养基 |
| glucose（g） | 28 | 50 | 40 |
| KNO3 | / | 8.75 | 7 |
| urea(g) /KNO3 | 4.8 | / | / |
| Na2HPO4.12H2O(g) | / | 3.15 | / |
| KH2PO4（g） | 1.2 | 1.2 | 1.25 |
| MgSO4.7H2O（g） | 1.2 | 1.2 | 1.0 |
| CaCl2.2H2O（mg） | 105 | 105 | 111 |
| FeSO4.7H2O（mg） | 16 | 16 | 49.8 |
| EDTA(mg) | 2.1 | 2.1 | 500 |
| 柠檬酸三钠(g) | 0.2 | 0.2 | / |
| 微量元素1（ml） | 1 | 1.78 | / |
| 微量元素2（ml） | / | / | 5 |
| H2O(ml) | 1000 | 1000 | 1000 |
| pH | 6.3 | 6.3 | 6.1 |
微量元素1溶液配方：H3BO3 2.86g，ZnSO4.7H2O 0.222g，MnCl2.4H2O 1.81 g，Na2MoO4 0.021g, CuSO4.5H2O0.07g，水 1000ml。
微量元素2溶液配方：H3BO3 22.84g，ZnSO4.7H2O 17.64g，MnCl2.4H2O 2.84g，MoO3 1.42g(Na2MoO4 2.03g),CuSO4.5H2O 3.14g，Co(NO3)2.6H2O0.98g，水 1000ml。
异养培养基响应面优化
使用Design expert 8.0设计Plackett-Burman 实验如下：根据蛋白核小球藻的参考文献，试验选用实验次数N-12的设计，对9个因素进行考察，并余留2个空白项以估计实验误差。每个因素取2个水平，以干重为响应值Y，每组实验设置平行2个，培养72h取样测定小球藻的干重。Plackett-Burman实验设计因素及水平见表， 实验设计矩阵见表。
表 Plackett-Burman设计实验参数和水平
| 编码 | 因素 | 低水平（-1） | 高水平（ 1） |
| X1 | Glucose浓度（g/L） | 10 | 40 |
| X2 | KNO3浓度（g/L） | 2 | 8 |
| X3 | KH2PO4浓度（g/L） | 0.6 | 4.8 |
| X4 | MgSO4.7H2O浓度（g/L） | 0.5 | 4.0 |
| X5 | CaCl2.2H2O浓度（mg/L） | 50 | 400 |
| X6 | FeSO4.7H2O浓度（mg/L） | 8 | 64 |
| X7 | EDTA浓度（mg/L） | 1 | 10 |
| X8 | 柠檬酸三钠浓度（g/L） | 0.1 | 1 |
| X9 | 微量元素浓度（ml/L） | 0.5 | 5 |
表 Plackett-Burman试验设计表
| 实验 | X1 | X2 | X3 | X4 | X5 | X6 | X7 | X8 | X9 |
| 1 | 1 | 1 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 | -1 | 1 |
| 2 | 1 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 |
| 3 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 |
| 4 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 | -1 |
| 5 | -1 | -1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 |
| 6 | 1 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 | -1 | 1 | 1 |
| 7 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 | -1 | -1 | 1 | -1 |
| 8 | -1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 | 1 |
| 9 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 |
| 10 | 1 | 1 | -1 | 1 | 1 | 1 | -1 | -1 | -1 |
| 11 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 | -1 |
| 12 | -1 | -1 | -1 | 1 | -1 | 1 | 1 | -1 | 1 |
采用Design expert对表2中各实验组数据进行回归分析，以得到各因子的偏回归系数及显著性。然后根据PB实验的实验结果确定的重要因子（葡萄糖、七水硫酸镁、微量元素），设定重要因子的步长和变化方向，使相应值快速逼近最大响应区间。接着采用Box-Behnken设计，以最陡爬坡实验得到的最优结果为中心点，对主要因子重新编码，设计三因素三水平的响应面实验，以干重为相应值，响应面因素水平见表，用Design expert 8.0软件对实验数据进行处理分析。最后，对响应面实验优化结果确定的各显著影响因素的最佳取值及预计结果进行验证，进行可靠性分析，得到最后优化结果。
异养培养基C、N、P配比优化
混料设计可保持各个因子的总和恒定，研究各因子比例变化时所得到的目标响应值最大。该方法不仅可以对各因子及其之间的交互作用进行分析，还可以根据目标响应值优化各因子组分，确定各因子最佳水平。将藻液按1.0g/L接种量接入装有150mL培养基的500 mL三角锥形瓶中。培养条件：30 °C，150 rpm摇床异养培养3天。对异养培养基中的葡萄糖（X1）、硝酸根（X2）、磷酸根（X3）进行混料比优化实验，实验设计见下表。然后应用Design expert软件对结果进行分析，分别对模型进行逐步回归拟合和分析。
表 蛋白核小球藻异养培养基的混料设计
| 实验号 | X1葡萄糖（%） | X2硝酸根（%） | X3磷酸根（%） |
| 1 | 60.00 | 30.00 | 10.00 |
| 2 | 74.88 | 19.01 | 6.11 |
| 3 | 86.80 | 13.10 | 0.10 |
| 4 | 60.00 | 30.00 | 10.00 |
| 5 | 80.65 | 18.50 | 0.85 |
| 6 | 65.76 | 28.06 | 6.18 |
| 7 | 75.47 | 24.44 | 0.10 |
| 8 | 69.90 | 30.00 | 0.10 |
| 9 | 90.00 | 5.00 | 5.00 |
| 10 | 85.00 | 5.00 | 10.00 |
| 11 | 68.12 | 21.88 | 10.00 |
| 12 | 74.88 | 19.01 | 6.11 |
| 13 | 74.88 | 19.01 | 6.11 |
| 14 | 90.00 | 5.00 | 5.00 |
| 15 | 65.76 | 28.06 | 6.18 |
| 16 | 78.91 | 11.69 | 9.40 |
异养培养条件优化
对蛋白核小球藻异养培养条件进行单因素优化，包括初始pH、接种量、装液量、种龄，明确这些条件如何影响小球藻的生长。采用250mL摇瓶在可控温摇床上进行，摇瓶装有改良的Endo培养基，经121°C灭菌20min，冷却后接种，在无光照、150rpm、30°C的条件下进行异养培养。
表 蛋白核小球藻异养培养条件单因素实验设计
| 因素 | 水平 | 其它条件 | ||||
| pH | 4.5 | 5.5 | 6.5 | 7.5 | 8.5 | 接种量1.0g/L，装液量100ml，种龄72h。 |
| 接种量（g/L） | 0.25 | 0.5 | 1.0 | 1.5 | 2.0 | pH6.3，装液量100ml，种龄72h。 |
| 装液量 | 150 | 200 | 250 | 300 | 350 | pH6.3，接种量1.0g/L，种龄72h。 |
| 种龄（h） | 24 | 48 | 72 | 96 | 120 | pH6.3，接种量1.0g/L，装液量100ml。 |
对蛋白核小球藻异养培养条件筛选出的单因素条件进行正交优化，考察因素之间的交互作用影响。采用500mL摇瓶在可控温摇床上进行，摇瓶装有改良的Endo培养基，经121°C灭菌20min，冷却后接种，在无光照、150rpm、30°C的条件下进行异养培养，每个实验重复2次。采用正交设计助手，设计4因素、3水平的正交实验。
可行性分析
目前，南京大学昆山创新研究院已从事多年的蛋白核小球藻培养工艺研究，已有一定的研究基础，且目前已取得了阶段性成果。同时，实验室还建有微藻基础培养平台和高端的微藻分析检测设备，可以开展多种微藻养殖和产品开发。相关研究人员在能源微藻培养、光生物反应器设计与优化、微藻油脂提取及非油脂组分资源化利用、LED光照设备检测等方面具有坚实的基础和丰富的经验，完全可以借助该平台完成本课题内容的研究。
4. 研究创新点
特色或创新之处
蛋白核小球藻饵料生产采用独创的“异养-饥饿循环培养”技术工艺，该方法将饵料细胞的培养分为了3个阶段：分批培养阶段、异养-饥饿循环培养阶段、蛋白质积累阶段。首先，藻细胞经活化培养后接种至生物反应器分批培养。其次，当细胞分批培养一段时间后流加补料培养基；流加培养一段时间后停止补料或降低补料速率，继续培养，调控细胞代谢处于饥饿状态，随后重新恢复流加补料培养基速度，调控细胞代谢恢复至营养代谢状态，如此循环往复。最后，当细胞密度达到预期值时，转至诱导阶段，通过控制流加补料速率或缺失某种底物营养成分，降低细胞生长速率，诱导蛋白质积累。
5. 研究计划与进展
第一阶段：（2020.3.28－2020.4.9）：资料收集、整理，确定论文的写作思路，技术路线，论文提纲，方法和应用。
第二阶段：（2020.4.10－2020.4.20）：完成论文的前言和试验方法部分。
第三阶段：（2020.4.21－2020.5.1）：完成论文的结果与讨论以及结论部分。
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