水稻粉质突变体F41的基因定位开题报告

1. 研究目的与意义

1.本项目的研究意义

1.1 理论意义

淀粉约占水稻籽粒胚乳中干物质含量的80%，是胚乳中最主要的储藏物质，胚乳内的淀粉分为直链淀粉和支链淀粉两类[1]。尽管其合成途径中的许多合成酶和调控因子都已经被很好地鉴定和研究,但是人类至今还无法在体外系统合成淀粉，淀粉的从头合成是一个复杂而精细的过程，在此过程中还有许多环节是未知的，因此深入研究水稻这一单子叶模式植物淀粉合成途径中关键因子及调控网络具有重要的理论意义。

2. 研究内容和预期目标

1.研究目标

1.1取突变体f41和野生型宁粳3号水稻种子进行表型分析。

1.2 用sds（sodium dodecyl sulfate）法提取水稻粉质突变体f41极端个体的dna，为后续f41的基因定位奠定基础。

3. 研究的方法与步骤

1. 研究方法

1.1 表型鉴定，胚乳超微结构的观察：

在灯箱下观察该突变体的异常表型,取野生型、突变体发育12DAF胚乳，用体视镜观察横切面。

1.2 基因精细定位与克隆

在F41/Dular F₁植株上收取F₂种子，自然干燥5-7天破除休眠后，除去外壳，在灯箱下挑取和F41突变体一样粉质不透明的种子，在无菌条件下（种子种植过程在超净台完成）发芽，待极端个体生长一个星期左右提取DNA。利用SDS方法提取DNA,筛选公共标记进行连锁，开发新标记利用扩大的F₂群体DNA及PCR反应程序进行扩增，然后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术鉴定带型，从而进行精细定位，并对定位区间进行基因预测。

2 .技术路线

（1） 以F41为母本Dular为父本进行杂交得到子代F₁。

（2） F₁自交得到F₂。

（3） 在F₂群体中挑选极端个体进行精细定位。

（4） 进一步进行预测基因及基因克隆。

3.实验方案

3.1材料

F41是宁粳3号（粳稻品种）经化学诱变剂N-甲基N-亚硝基脲(MNU)处理后，筛选到的胚乳粉质突变体。该突变体与一个粳稻品种日本晴配组得到F₁，F₁单株自交收获F₂的种子，利用F₂群体分离出的具有粉质表型的极端个体对突变基因进行图位克隆。水稻植株生长于南京农业大学土桥实验基地。

3.2方法

3.2.1突变体和野生型的显微镜观察

将成熟的野生型和突变体的糙米在体视镜下观察，并用锋利的单面刀片从中间断开，体视镜观察断面。

3.2.2种子千粒重测定

将完熟的野生型和突变体种子，置于60℃恒温烘箱内数日，待样本恒重后随机挑选1000粒种子进行测定，并重复三次取平均值。

3.2.2.1种子发苗

在F41/Dular F₁植株上收取F₂种子，自然干燥后，去除外壳，在X胶片观察灯下挑选和突变体F41一样粉质不透明的种子，在无菌环境下发芽，待极端个体长一周左右时提取DNA。种植方法如下：用含有0.5% 吐温-20的蒸馏水清洗种子5min，后移至在20%的84溶液中浸泡种子30min，用灭菌水清洗5次，每次5min，然后将种子移至无菌滤纸上吹干，最后将种子分散放置MS无菌固体培养基上（所有操作应在超净工作台内完成）。

3.2.2.2植物总DNA的提取（SDS法）

（1）试剂准备

本实验室采用SDS法抽提水稻基因组DNA。溶液配制如下：

1. SDS提取液：

SDS 12g，

1.0M Tris-HCl（pH8.0） 100mL，

0.5M EDTA（pH8.0） 50mL，

NaCl 29.25g，

ddH₂O 60℃溶解，定容至1000mL，灭菌后室温保存。

2. KAc：

HAc 29.5mL，

加80mL ddH₂O，冰上用KOH调至pH 4.8，定容至100mL，室温保存。

3. 氯仿抽提液：氯仿:异戊醇=24:1（体积比）混匀。

4. 无水乙醇。

5. TE缓冲液（pH 8.0）：

1.0M Tris-HCl（pH8.0） 5mL，

0.5M EDTA（pH 8.0） 1mL，

ddH2O定容至500mL，灭菌后室温保存。

（2）DNA提取步骤如下:

1.取适量水稻叶片，均匀剪碎后置入2mL Ep管中，放入钢珠，液氮冷冻1min后， 用组织仪将叶片打成粉末状；

2.迅速取出钢珠，并加入600μL SDS提取液摇匀（SDS提前65℃温浴），65℃温浴 30min，期间颠倒2-3次；

3.加入125μL 5M KAC、摇匀后冰上放置30min；

4.加入400μL氯仿-异戊醇（24:1），在摇床上150rpm充分摇匀；

5.12000rpm离心10min，转移500μL上清液至另一Ep管中；

6.重复步骤4, 5；

7.加入-20℃预冷的无水乙醇800μL，轻柔混匀；

8.-20℃静置20min，4℃，12000rpm离心5min；

9.弃上清，每管加入70％乙醇600μL冲起沉淀，12000rpm离心5min，弃上清液（注意勿将沉淀倒出），在超净工作台上风干；

10.加入200μL TE缓冲液溶解DNA，用 ，进行DNA质量和浓度检测。每份DNA统一用ddH₂O稀释成20ng/μL 的浓度，作为PCR扩增的模板。将母液稀释5-10倍作为工作液。

3.2.2.3PCR扩增

（1）PCR扩增体系：

PCR反应体系为10μL，包括：1μL DNA模板（约20ng），1μL引物(0.2μM)，1μL dNTP(50μM)，1μL 10buffer（Mg² plus）和0.1μL Taq（0.5U/μL）DNA聚合酶（TakaRa，大连），用ddH₂O补足10μL反应体系。

（2）PCR反应程序：

94℃ 5min，94℃ 30S，55℃ 30S，72℃ 1min，35个循环，72℃ 10min，4℃保存。

3.2.2.4PCR产物检测

（1）采用聚丙烯凝胶电泳分离PCR产物：

100mL 8%凝胶工作液配方为：dd H₂O 70 mL，10TBE 10 mL，40%丙烯酰胺(19:1) 20mL，10% AP 1mL，TEMED 0.1mL（最后加入），根据需要制胶的数量调整凝胶工作液的量。10TBE（1L）：将108g Tris碱和55g硼酸溶解于少量蒸馏水，加40mL EDTA (0.5mol/L，pH 8.0)，再加蒸馏水定容到1L。19:1丙烯酰胺凝胶储液(100mL)：将38g丙烯酰胺和2g N', N'-亚甲双丙烯酰胺溶解于ddH₂O，定容至100mL，过滤后4℃保存。将扩增好的PCR产物加上双色指示剂，进行电泳检测，根据PCR产物的大小调整电泳时间（可根据双色指示剂判断）。

（2）银染显色方法：

银染显色程序参照Sanguinetti等（1994）的方法略有修改，方法如下：

（1）在胶上加入0.2%的AgNO₃溶液，摇床上摇动5-8分钟；

（3）倒掉AgNO₃溶液，加入蒸馏水漂洗2-3次；

（4）加入200mL显色液（1.5%氢氧化钠（W/V），0.4%甲醛（V/V）），摇床上摇动至条带清晰；

（5）条带清楚后，倒掉显色液，用水清洗凝胶2次；

（6）用保鲜膜包裹凝胶，读胶并记录实验结果。

3.2.2.5标记筛选及基因精细定位

利用实验室分子标记库筛选两亲本之间存在良好多态的SSR标记，并从中选择位于不同染色体上的分子标记（间距不大于15cM）进行连锁分析。具体地，将突变体的带型记录为1，将日本晴带型记录为2，杂合型记录为3。在F₂极端隐性个体的群体中筛选全是1型的分子标记。在寻找到连锁标记之后，在其附近继续开发标记，进行精细定位。引物设计根据NCBI已经公布的日本晴和9311基因组序列上的差异，使用Primer Premier5软件设计SSR，Indel标记。

4.可行性分析

本实验在南京农业大学水稻所万建民实验室开展和进行的，该实验室师资力量雄厚，配套实验设备齐全，在研课题多样，这为本实验的开展和进行提供了优越的实验条件和充足的信息来源；指导教师是钟山学术新秀王益华教授，他学识渊博，为人和蔼，乐意为我们解答疑惑之处；同时学校的土桥实验基地可以满足田间试验。而我已经完成了大学期间课程的学习，拥有专业的学科素养，并且在先前的SRT研究中得到了锻炼，这为这次毕业设计的课题打下了坚实的基础。我相信通过我认真钻研，仔细实验，虚心请教，一定能完成本次实验。

4. 参考文献

1．本实验的创新之处

淀粉的合成是个很复杂的过程，在胚乳发育过程中由糖转变成淀粉的过程是在一系列淀粉合成关键酶的催化下的酶促反应。通过筛选突变体库，获得了一份新的粉质突变体，并且通过图位克隆的方法得到突变基因。利用突变体结合图位克隆技术获得新的基因为研究其功能奠定了基础。

5. 计划与进度安排

1.项目研究计划

2022年1月至2月：对突变体f41进行表型分析。

2022年2月至3月：对突变体f41的基因进行初定位。