腊鱼中细菌的分离、纯化和鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

本课题的意义：

高蛋白、低脂肪、含水量大、不饱和脂肪酸多、不易储藏等特点^[1]使得腌制、干制、熏制、糟制等一些具有悠久历史的中国传统加工方法成为我国水产品加工储藏的主要途径^[2]。腊鱼作为我国一种颇具特色的传统水产加工食品，主要是以淡水鱼为原料经食盐腌制和干燥加工而成,较低的温度和较高的食盐浓度是其进行自然发酵的前提。腌腊制品之所以可以产生香味，是因为微生物在腌制品中生长时, 可分泌一些酶^[3]。

盐渍和熟成是腊鱼生成的两个重要过程。在盐渍过程当中，鱼体被浸泡在盐水中，或是直接与固体盐颗粒接触。在食盐向鱼体内部渗透的同时，一部分水从鱼体中除去，鱼体的水分活度因此而降低了。这个过程可以起到抑制腐败变质的作用。盐渍过程通常是一个较长的周期。在这期间，鱼体原有的组织状态逐渐失去，而它原本固有的风味特点也会会变成咸鱼特有的风味。与盐渍相比，熟成则是一个生物化学过程。在这个过程中，鱼肉组织蛋白质和脂肪分解酶发挥作用，从而产生了一系列的物理变化和化学变化。

2. 研究的基本内容和问题

研究目标：

1、分离纯化腊鱼腌制中的优势细菌

2、研究不同菌种对腊鱼品质的影响

3. 研究的方法与方案

研究方法：运用固相微萃取与气-质联用技术研究不同菌种对腊鱼品质的影响。

技术路线：新鲜草鱼除杂，洗净、切块，加花椒盐，拌匀腌制（其中接种纯化培养的菌种），最后得到成品，一部分成品进行生物学特性测定细菌总数，另一部分测定风味物质成分，确定最佳发酵方法。

实验方案：

1、菌种的培育：取腊鱼样品25g，剪碎后加入到装有225ml无菌水的三角瓶中（瓶中预先放一定数量的小玻璃珠），震摇30min，然后梯度稀释至合适浓度。无菌条件下取1ml稀释样液，转移到9cm培养皿中，然后倒入改良MRS培养基，混匀后37℃培养48h。以肉眼观察培养皿中菌落的形态特征。分布于培养基底层或者中部，米黄或者白色，有光泽，圆形或者针尖状的菌落可初步认定为乳酸菌的疑似菌落。革兰氏染色及显微镜观察取新鲜的分离较好的乳酸菌的疑似菌落制成水涂片，革兰氏染色后，在10100倍显微镜下观察样品的颜色和形状。紫色杆菌或球菌可进一步认定为乳酸菌的疑似菌落。乳酸菌的纯化培养用接种环挑取经显微镜观察认定为乳酸菌的意思菌落，划线接种于改良MRS。琼脂斜面上，37℃培养48h至72h。重复操作，不断纯化直至得到单菌落。

2、风味腊鱼接种并发酵

3、理化指标分析

（1）水分含量的测定

取洁净铝制或玻璃制的扁形称量瓶，置于95～105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，加热0.5～1.0h，取出盖好，置干燥器内冷却0.5h，称量，并重复干燥至恒量。称取2.00～10.0g切碎或磨细的样品，放入此称量瓶中，样品厚度约为5mm。加盖，精密称量后，置95～105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2～4h后，盖好取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量。然后再放入95～105℃干燥箱中干燥1h左右，取出，放干燥器内冷却0.5h后再称量。至前后两次质量差不超过2mg，即为恒量。

（2）NaCl含量的测定

采取GB/T 12457-2008 中的间接滴定法。

试液经酸化处理后，加入过量的硝酸银溶液，以硫酸铁铵为指示剂（佛尔哈特法），用硫氰酸钾标准滴定溶液滴定过量的硝酸银，根据硫氰酸钾标准滴定溶液的消耗量，计算食品中氯化钠的含量。

（3）粗蛋白含量的测定

采用GB5009.5-2010的凯氏定氮法。

食品中的蛋白质在催化加热条件下分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗乘以换算系数，即为蛋白质的含量。

（4）粗脂肪含量的测定

采用GB/T 5009.6-2003的索氏提取法。

试样用无水乙醚或石油醚等溶剂提取后，蒸去溶剂所得的物质，称为粗脂肪。因为除脂肪外，还含色素及挥发油、蜡、树脂等物。提取法所测得的脂肪为游离脂肪。

（5）挥发性盐基氮（TVB-N）含量的测定

采用GB/T5009.44-2003的半微量定氮法。

挥发性盐基氮是指动物性食品由于酶和细菌的作用，在腐败过程中，使蛋白质分解而产生氨以及胺类等碱性含氮物质。此类物质具有挥发性，在碱性溶液中蒸出后，用标准溶液滴定计算含量。

（6）组胺含量的测定

采用GB/T5009.45-2003方法。

鱼体中组胺用正戊醇提取，遇偶氮试剂显橙色，与标准系列比较定量。

（7） 酸价的测定

油脂提取时，称取用绞肉机绞碎的100g试样于500ml具塞三角瓶中，加100ml~200ml石油醚（30℃~60℃沸程）振荡10min后，放置过夜，用快速滤纸过滤。

采用GB/T5009.37-2003的方法。

植物油中的游离脂肪酸用氢氧化钾标准溶液滴定，每克植物油消耗氢氧化钾的毫克数，称为酸价。

（8） 过氧化值的测定

油脂提取时，称取用绞肉机绞碎的100g试样于500ml具塞三角瓶中，加100ml~200ml石油醚（30℃~60℃沸程）振荡10min后，放置过夜，用快速滤纸过滤。

采用GB5009.37-2003的滴定法。

油脂氧化过程中产生过氧化物，与碘化钾作用，生成游离碘，以硫代硫酸钠溶液滴定，计算含量。

（9）挥发性风味组分的分析：运用固相微萃取与气联用技术

称取0.4g腊鱼粉末置于5ml萃取瓶中，立即封闭瓶口。迅速将样品加热到35e，保持温度恒定。用固相微萃取手柄加工探头送入萃取瓶中，推出探头，使探头置于样品的上部，暴露30min。

取出萃取平衡的探头，立即在气象色谱-质谱仪上直接热解析，并进行色谱-质谱分析。色谱条件：30m0.25mm0.25Lm CP-Si18

毛细管色谱柱：1min不分流进样；进样口温度，230℃；升温程序，从90℃以20℃/min升温到200额，然后以25℃/min升温到290℃；以氦气作为载气，流速0.8mL/min。质谱条件：70 eV EI源；150℃井温；传输线温度，280℃；溶剂延迟时间，5min。

可行性分析：

1、腊鱼的口感、风味和品质在很大程度上受生产条件和发酵剂的影响。只要合理的控制加工过程中的生产条件以及合理的发酵剂，就可以较好的抑制鱼体中的微生物的生长和自身內源酶的活性，从而控制腊鱼品质的变化，提高产品食用安全性。

2、指导老师陈晓红教授长期从事发酵食品的研究工作，积累的大量的研究经验并且已经取得了很多的科研成果，且实验室学术氛围浓厚，气氛活跃，相信在这样的环境中，我们可以更好地实现预期目标。

3、通过大学四年的学习，我已经积累了一定的微生物和微生物实验操作以及生物化学方面的知识，阅读了大量的相关文献，对所研究的项目研究现状、研究背景和研究目的有着较为明确的目标。

4. 研究创新点

本实验将腊鱼中的优势乳酸菌作为接种菌进行人工发酵以及将腊鱼进行自然发酵，测定腊鱼的理化性质和挥发性物质的组成，研究不同的菌种发酵对腊鱼品质的影响，确定最适腊鱼发酵的菌种。

5. 研究计划与进展

2013年3月2013年4月 熟练掌握培养基配制方法，无菌操作的要点以及腊鱼的制作工艺

熟练掌握菌种活化及菌种的操作技术

2013年4月2013年5月 熟练掌握固相微萃取与气-质联用技术，测定腊鱼的理化性质，以感官评价和理化指标来选择最合适的发酵剂。