Ca2 对高温胁迫小麦幼苗逆境指标的影响开题报告

1. 研究目的与意义

小麦（triticum aestivumlinn.）是我国仅次于水稻的第二粮食作物，也是我国北方最喜爱的主食。我国有2种小麦，春小麦与冬小麦，种植以冬小麦为主。冬小麦一般在9月中下旬至10月上旬播种，其适合生长温度为15~20℃。

小麦的生长过程中会遇到高低温、盐碱、强光、少雨等诸多不利因素的胁迫。其中，高温作为影响农作物生长的胁迫因子之一，常常引起植物的结构与功能发生重大的破坏，从而使植物生长受到炼制，进而影响到产量。

近年来, 随着温室效应的加剧, 全球气温的上升直接威胁着二十一世纪农业生产方向。植物生产面临着高温胁迫( heat stress) 的严峻挑战。因此研究高温对植物生理特性的影响已经成为一个全球性的课题。我国作为小麦的主产区之一，高温胁迫也是影响我国小麦产量的重要因素，所以研究高温胁迫对小麦幼苗生理生化的影响，有助于采取相应的措施来减轻高温对小麦的伤害。

2. 研究内容和预期目标

高温是限制植物生长、地理分布、作物产量的一种主要环境因子，无论是耐高温植物还是不耐高温植物均有可能遭受高温的伤害；研究高温对植物生理特性的影响已经成为一个全球性的课题。为此，可采用模拟高温实验法，选择小麦幼苗期作为实验时段，研究高温（35℃）对小麦幼苗逆境指标的影响。

近几年来生理学研究发现,外施Ca² 可以增强植物对许多非生物逆境的适应性,减轻逆境对植物所造成的伤害。所以，可采用不同浓度的Ca² 对高温胁迫小麦幼苗进行处理,通过对不同逆境指标（叶绿素总量、SOD酶活性、丙二醛含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量等）的测定,分析Ca² 在小麦幼苗高温逆境胁迫过程中的作用,为探讨提高小麦的抗逆性奠定基础。

本实验力求客观反映Ca² 、高温胁迫对小麦幼苗处理后可能存在的剂量效应和时间效应。

3. 研究的方法与步骤

1.小麦幼苗的培养

将小麦种子用蒸馏水洗2~3次，挑除杂质，漂去漂浮的种子。淘洗后，将种子放置于底部有滤纸的培养皿上，每个培养皿都一定量的种子，然后加入适量的蒸馏水，盖好培养皿。再将其放入25℃的恒温箱中催芽。等芽长大2cm左右时，可以于光照培养箱中加完全培养液培养。当芽长大约10cm左右时可以转移到培养瓶中培养。待小麦幼苗长出2片真叶时，可以进行胁迫实验。

2.实验处理

（1）温度的选择

前期通过预实验，拟定35°C与40°C为胁迫温度，通过实验观察与叶绿素等相关实验指标的测量，最终决定选用哪个温度为正式实验温度。

（2） 实验处理

将小麦幼苗进行分组，高温胁迫组：利用（0mmol·L^-1CaCl₂）完全培养液、5mmol·L^-1CaCl₂完全培养液、10 mmol·L^-1CaCl₂完全培养液、15 mmol·L^-1CaCl₂完全培养液，置于35℃的恒温培养箱中培养；另取适量幼苗作为常温对照组，置于25℃的恒温培养箱中培养。整个实验过程中必须保证小麦幼苗培养液充足。然后在实验处理的第1d，3d，5d，7d，9d时分别测定两组幼苗的叶绿素含量，MDA含量，可溶性糖，Pro含量以及SOD酶的活性。

3 叶绿素含量的测定

实验步骤：直接使用叶绿素计测量不同处理的各个实验组的叶绿素含量。所有叶片统一取距离叶尖5-10cm的部分进行测量，每组测量10次，取平均值。

4 MDA的测定——硫代巴比妥酸法

实验步骤：称取0.5g小麦幼苗叶片,加入1mL10%三氯乙酸(TCA)、石英砂研磨；进一步加入4mL10%TCA充分研磨。将匀浆液转入离心管,于4000r·min^-1离心10min,上清夜即MDA提取液。取2mLMDA提取液,再加2mL硫代巴比妥酸(TBA)于沸水浴中反应15min，迅速冷却，离心。取上清液于450nm处和532nm处测定OD值,再根据公式计算可溶性糖和MDA含量。对照管以2mL水代替提取液。

结果计算：C_MDA=6.45A₅₃₂－0.56A₄₅₀(μmol·L^-1)

C糖=A₄₅₀/85.4=11.71A₄₅₀(mmol·L^-1)

公式中：A₄₅₀—450nm波长下测得的吸光度值；

A₅₃₂—532nm波长下测得的吸光度值

C_MDA、C糖分别是反应混合液中MDA、可溶性糖的浓度。

5 脯氨酸的测定

实验步骤：(1) 脯氨酸标准曲线的制作：取11支10mL容量瓶，编号，按下表配制每管含量为0～10μg的脯氨酸标准液。

取11只带塞试管，分别吸取2mL系列标准浓度的脯氨酸溶液,加2mL3%的磺基水杨酸，2mL冰醋酸和4mL2.5%酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中显色1h，取出冷却，各试管再加入4mL甲苯，振荡30s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，在520mm波长处测定吸光度值。以1～11号管脯氨酸含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。计算2mL测定液中脯氨的含量(μg·mL^-1)。

(2) 样品的测定：称取不同处理的植物叶片各0.5g，加入5mL3％的磺基水杨酸溶液，加入石英砂充分研磨，匀浆移至离心管中，在沸水浴中提取10min(提取过程中要经常摇动)，冷却后在3000r/min下离心10min。吸取2mL提取液于带玻塞试管中，分别加入2mL的蒸馏水，2mL冰醋酸及4mL2.5﹪酸性茚三酮试剂，与上述制作标准曲线一样进行显色，萃取和鼻塞，最后从标准曲线查得脯氨酸的含量。

6 可溶性糖的测定——蒽酮比色法

实验步骤：（1）标准曲线的制作：将分析纯蔗糖在80°C下烘干至恒重，精确称取1.00g。加入少量水，转入100mL容量瓶中，加入0.5mL的浓硫酸，用蒸馏水定容。精确吸取上述蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水至刻度。取11只刻度试管，按下表加入溶液和水。

然后按顺序向试管加入0.5mL蒽酮乙酸乙酯和5mL浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水中，逐个保温1min，取出后自然冷却到室温，以空白做参比，在630nm波长下测其吸光度，以吸光度为纵坐标，以糖含量为横坐标，绘制标准曲线，并求出线性方程。

（2）可溶性糖的提取：取新鲜叶片，擦净表面，称取0.3g叶片，剪碎，放入20mL的试管中，加入10mL的水，加塞，以沸水中提取30min，过滤；将剩余的叶片再次加入10mL的水沸水30min，过滤，提取液过滤如25mL的容量瓶中，仿佛漂洗试管及残渣，定容至刻度。

（3）显色测定：吸取提取液0.5mL于20mL刻度试管中，加入1.5mL的蒸馏水，以下与标准曲线测定相同，测定样品的吸光度，计算可溶性糖的含量。

7 SOD的测定——邻苯三酚自氧化法

实验步骤：（1）提取液的制备：取小麦幼苗的叶片0.5g，加入0.1mol/l的磷酸缓冲液6mL，少许石英砂，充分研磨，将匀浆转至离心管中，在12000r/min，3℃下离心20min；去离心液的上清于64℃下热激20min，再在5000r/min，16℃下离心15min，上清液待用。

（2）邻苯三酚自氧化速率的测定：在10mL的试管中加入5mL的Tris-HCl缓冲液，于25℃下保温20min；随后精确加入20μL的（于25℃下已预热好的）邻苯三酚溶液，在起始和3min后记下OD_325nm的值，差值为A₀；

（3）酶活力的测定：在10mL的试管中加入5mL的Tris-HCl缓冲工作液以及20μL的待测SOD稀释液，于25℃下保温20min；随后精确加入20μL的（于25℃下已预热好的）邻苯三酚溶液，在起始和3min后记下OD_325nm的值，差值为As。

抑制率=(A₀-As)/A0×100%

SOD活力（U/mL）=((A₀-As)/(A₀×0.5))×n/V

式中：V为加样体积; n为样品稀释倍数;0.5即一直自氧化反应的50%

A₀为初始速率，As为3min后的速率

4. 参考文献

[1]赵福庚,何龙飞,罗庆云.植物逆境生理生态学[m].北京:化学工业出版社,2004,4

[2]张志良,徐伟菁.植物生理学实验指导[m].高等教育出版社,2010.

[3]郭洪雪,宋希云,燕增文等.高温胁迫对小麦幼苗几个生理生化指标的影响[j].华北农学报,2007,22:71-74.

5. 计划与进度安排

1.2022-12-19 确定选题；

2.2022-12-26 — 2022-02-24 接受任务，完成开题准备；

3.2022-02-27 — 2022-03-10 上交开题报告；