镧络合物对酸雨胁迫下番茄生理指标的影响开题报告

1. 研究目的与意义

我国许多城市和地区普遍出现酸雨现象，苏州是江苏酸雨发生频次和程度最严重的地区。酸雨对植物的危害表现在直接影响和间接影响.直接影响是直接作用于植物全身; 间接影响体现在土壤酸化后结构、营养成分、通气等的劣化。

酸雨对植物酸致伤害机理有离子效应、质子效应、光合抑制效应和自由基效应,对于酸雨较敏感的植物,对酸雨的耐受程度较低,从种子萌发到幼苗生长的全过程都发生剧烈的变化。酸雨首先伤害植物的叶片,其伤害程度与酸雨的酸度、频度和时间呈正相关关系。另外,酸雨还能够降低农作物和蔬菜种子的发芽率,降低大豆的蛋白质含量,使其品质下降。我国是农业大国,而同时也是第三大酸雨区国家,每年我国由于酸雨而导致的损失不计其数,酸雨不仅可以通过伤害叶表面而造成对植物的损伤,同时还可以改变植物生长环境的土壤酸碱度,从而进一步加剧了土壤中重金属(zn、cd、cu等)的可释态,而重金属对植物生长有很大的影响,从而导致一系列恶性循环现象出现。镧在较大程度上可提高作物抗逆性的能力,保证作物在一定的逆境范围内仍能正常生长发育,可通过探测因酸雨胁迫导致的植物细胞内超氧化物歧化酶、过氧化物酶等酶活性消长变化幅度来确定镧对酸雨胁迫下敏感植物的影响。本研究旨在揭示敏感植物番茄在酸雨胁迫下种子萌发和幼苗生长的变化及镧的保护作用,为防止酸雨胁迫提供理论依据和实践指导。

本课题以苏州地区地产蔬菜番茄为研究对象，利用一定浓度的镧络合物对幼苗期的材料进行叶面喷施，研究酸雨对幼苗期番茄的影响及验证镧络合物的抗逆效果，为研究酸雨的危害提供丰富的基础数据，为进一步在苏州地区推广使用镧络合物减轻酸雨危害和发现一种减轻酸雨危害新型合成物打下基础。

2. 研究内容和预期目标

研究内容：

镧在较大程度上可提高作物抗逆性的能力,保作物在一定的逆境范围内仍能正常生长发育,可通过探测因酸雨胁迫导致的植物细胞内超氧化物歧化酶、过氧化物酶等酶活性消长变化幅度来确定镧对酸雨胁迫下敏感植物的影响。本研究旨在揭示敏感植物番茄在酸雨胁迫下种子萌发和幼苗生长的变化及镧的保护作用,为防止酸雨胁迫提供理论依据和实践指导。

3. 研究的方法与步骤

本课题拟采用溶液培养法研究镧络合物对酸雨胁迫下番茄种子萌发及幼苗生长的影响。具体步骤：第一步：番茄的培养

第二步：番茄幼苗保护最佳镧浓度的筛选

第三步：镧对酸雨胁迫下番茄幼苗生长的影响

第四步：结果的分析与讨论

① 叶绿素含量的测定（叶绿素仪法）：

模拟酸雨对照实验，共三组（对照组，酸雨组，酸雨 镧络合物组），确定镧络合物浓度、酸雨pH

实验步骤：1、首先将手持式叶绿素仪的测量头夹在叶片两端,按下测量头。2、在使用手持式叶绿素仪校准过程中,测量头不夹样品,二个LED次序发光,被接收的光转换成电信号,光强度的比率被用来计算。3、在手持式叶绿素仪的测量头夹住样品后,二个LED再次发光,通过叶片传输的光扌到接收器上,被转换成电信号,传输光的强度比率被计算。4、步骤1和2的值用于计算SPAD测量值,就可以分析出所测叶片的叶绿素含量。

② 丙二醛(MDA)含量的测定:

模拟酸雨对照实验，共三组（对照组，酸雨组，酸雨 镧络合物组），确定镧络合物浓度、酸雨pH

[材料、仪器、药品]

1.材料:植物抗逆性鉴定实验中的番茄样品高温处理和室温对照。

2.仪器:(1)分光光度计: (2)离心机;(3) 水浴锅:(4)天平:(5)研钵; (6)剪刀; (7) 5ml刻度离心管: (9) 刻度试管(10m); (“)银子: (11)1 移液管(Sml. 2m、1m1); (12)冰箱。

3.药品:

(1) 0. 05mol/L pH7. 8磷酸钠缓冲液:

(2)石英砂;

(3) 5%三氯乙酸溶液:称取5g三氯乙酸,先用少量蒸馏水溶解，然后定容到100ml ;

(4) 0.5%硫代巴比安酸溶液:称取0.5g硫代巴比安酸，用5%三氰乙酸溶解。定容至10.即为0. 5%硫代巴比妥酸的5%三最乙酸溶液。

[方法]

1.丙二醛的提取:取0.5g样品,加入2ml预冷的0. 05moI/LpH7.8的磷酸缓冲液，加入少量石英砂，在经过冰浴的研钵内研磨成匀浆，转移到5ml刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗也移入离心管中，最后用缓冲液定容至5ml。在4500转/min离心10min。上清液即为丙二醛提取液。

2.丙二醛含量测定:吸取2ml的提取液于刻度试管中,加入0.5%硫代巴比妥酸的5%三氯乙酸溶液3ml，于沸水浴上加热10min,迅速冷却。于4500转/min离心10min。取上清液于532、600nm 波长下,以蒸馏水为空白调透光率100%，测定吸光度。

③ 过氧化物酶(POD)活性测定：

模拟酸雨对照实验，共三组（对照组，酸雨组，酸雨 镧络合物组），确定镧络合物浓度、酸雨pH

称取组织1g放于研钵中，加5mL0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH5.5)在冰浴中研磨成匀浆。将匀浆全部转入离心管中，在3000rpm，4。C条件下离心10min，上清液为酶粗提液，4^。C保存备用。取酶液100μL,加反应混合液1、2.9ml0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH5.5)2、1mL0.05molL愈创木酚溶液，0.05molL愈创木酚溶液,0.06207g愈创木酚定容10ml

3、1.0ml2%H2O2,30%H2O2670μL，加水至10ml.在37C水浴中混合均匀，于470nm处测定其吸光度，连续记录3min。以不加酶的反应混合液作对照，每30秒钟读一次数，以每分钟吸光度值变化值0.01为一个酶活单位。酶活计算:0D290.g-1.FW.H-1=OD变化值/材料鲜重/反应时间POD的酶活性增加倍数与抗病性呈正相关

4.酶活性计算：

以每min OD值变化(升高) 0.01为1个酶活性单位(u)。

POD= (u/g min)

其中ΔA470为反应时间内吸光度的变化;W为样品鲜重;t为反应时间;Vt为提取酶液总体积;Vs为测定时取用酶液体积。

④ 超氧化物歧化酶(SOD)活性测定：

模拟酸雨对照实验，共三组（对照组，酸雨组，酸雨 镧络合物组），确定镧络合物浓度、酸雨pH

1材料与方法

1.1 试剂和仪器

(1)邻苯三酚溶液:用10mmol/L 的盐酸溶液配制成45mmol/L的溶液,此溶液须临用现配。

(2)Tris-HCl- EDTA缓冲液:配制50mmol/L的Tris-HCI缓冲液，内含1mmol/L的EDTA溶液,调pH为8.2

(3)WFZ800-D3型紫外可见分光光度计。

1.2样品

取样品10g(精确至0.001)。用水浸泡或榕解定容至100m!过滤,取滤液备用。

1.3方法。

1.3.1试验方法:

(1)邻苯三酚自氧化速率的测定,取pH8.2的Tris-HCl-EDTA缓冲液4.5ml于10ml比色管中,于25C恒温10min.再加入25C恒温的45mmol/L的邻苯三酚溶液10ul,混勾后迅速于1em石英比色杯325nm波长测光密度值,每隔30s测一次光密度值共测4min,求出邻苯三酚的自氧化速率OD_A/min同时用10mmol/L的盐酸做空白试验。

(2)SOD活性测定:取pH8. 2的Tris-HCl - EDTA缓冲液4.5ml于10ml比色管中,25C恒温10min,加人已恒温至25C的样品溶液10ml,迅速混匀,于325nm波长测定密度值,30s测-次,测4min,求出光密度值变化速率OD_A/min.

(3)计算:

酶活力(U/m)

OD.-ODe

ODA *100% n

50% *V1* v2

V1一反应液总体积,ml

V2--测定样晶体积,ml

n-样晶稀释液倍数

OD_A-邻苯三酚的自氧化速率。

OD_B-样品光密度值变化速率。

2结果与讨论

2.1 样品溶液有少许颜色对本试验没有干扰。

2.2用本方法连续测定同一SOD型口服液共计6次，测定结果为(U/ml):850土10.59,RSD=1.25.用同样方法测定了SOD酶稀释液酶活力单位相当于1000U/ml,回收率为98.1%

2.3 使用本方法分析速度快,干扰少,特异性强 .SOD最低检测浓度可达10-10~ 10- "'mol/L.

⑤ 过氧化氢酶(CAT)活性测定：

模拟酸雨对照实验，共三组（对照组，酸雨组，酸雨 镧络合物组），确定镧络合物浓度、酸雨pH

1.设置两个重复-个对照测定体系包括

（A）0.2 m1酶液、

（B）1.5 ml磷酸缓冲液pH7.0、

（C）3.1 ml蒸馏水，

（D）25^。C预热后逐管加入300μL 0.1 mol/L的H₂O₂(30% H₂O₂56.8μL加水至10ml.)

在240 nm下测定吸光度，每隔1 min读- -次，共测3 min,以1 min内减少0.1的酶量为1个酶活单位。

2.结果计算：

以每克鲜样品1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。

过氧化氢酶活性(u/g/min)=Δ

式中ΔA240= AS0－(AS1 AS2）/2；

AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；

AS1, AS2—样品管吸光值；

VT—粗酶提取液总体积（ml）；

Vt—测定用粗酶液体积（ml）；

W—样品鲜重（g）；

0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；

t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。

⑥ 硝酸还原酶活性的测定：

模拟酸雨对照实验，共三组（对照组，酸雨组，酸雨 镧络合物组），确定镧络合物浓度、酸雨pH

一、实验材料、仪器和试剂

1 、实验材料植物的叶，本实验选用番茄叶

2、仪器

(1)分光光度计(2)离心机(3)真空泵和真空干燥器(4)恒温水浴锅(5)恒温箱(6)刻度吸管(1m1、2m1、5m1)(7)试管(8)天平(9) 三角瓶(50m1)

3 、试剂

(1)亚硝酸钠标准液:称取0. 1000g亚硝酸钠(AR)，用蒸馏水溶解并定容至100ml。然后吸取5m1再用蒸馏水定客至1000m1。即为浓度5μg, ml的亚硝. 酸钠标准液。

(2)0. 1mo1/LpH7. 5磷酸缓冲液, 1(3)0.2 mo1/L的硝酸钾溶液

(4)对氨基苯磺磷酸

(5)a萘

(6)三氯乙酸

二、操作步骤

1 、标准曲线的制作取6支试管，编号，按下表操作

表1 样品处理加入试剂的种类和编号（ml）

按照上表加入各种试剂后，抽气10min，当叶片切段下沉后，于30℃保温30min，进行酶促反应。

注意：表中1、2号为对照，抽气前加入三氯乙酸；3、4号为处理，保温后加入三氯乙酸以终止酶活性。

表2 测定NO₂-加入各种反应试剂的顺序和体积（ml）

分别向各管加入对氨基苯磺酸和α-奈胺试剂各2 mL，然后静置30min，于520 nm测定吸光值（A）。

注意：8-11号为样品液测定管。标准液浓度为5μg/mLNO₂-

三、结果计算

根据标准曲线求得样品液中NO₂-浓度，用公式计算硝酸还原酶活性：

酶活性（NO₂-μg·g^-1FW·h^-1）=

式中：C为样品液中的NO₂-μg数；Vt为样品提取液总体积（mL）；Vs为测定时取用样品提取液体积（mL）；FW为鲜重（g）；t为酶促反应时间（h）。

⑦ 脯氨酸含量测定：

模拟酸雨对照实验，共三组（对照组，酸雨组，酸雨 镧络合物组），确定镧络合物浓度、酸雨pH

(一)材料及设备

1.材料仪器械:(1)待测植物(水稻、小麦、玉米、高梁、大豆均可)。(2) 722分光光度计，(3) 研钵，(4) 100ml 小烧杯，(5) 容量瓶，(6) 大试管2支，(7) 普通式管8支，(8) 移液管; (9) 注射器; (10) 水浴锅，(11)漏斗，(12)漏斗架，(13)滤纸，(14)剪刀。

2.试剂

(1)酸性茚三酮溶液:将1. 25茚三酮溶于30ml冰醋酸和20ml 6M磷酸中, .搅拌加热(70'C)溶解，贮于冰箱中。

(2) 3%磺基水杨酸: 3g磺基水杨酸蒸馏水溶解后定容至100ml。

(3)冰醋酸

(4)甲苯

(二)实验步骤

1.标准曲线的绘制

(1)在分析天平上精确称取25mg脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每毫升含脯氨酸100μg。

(2)系列脯氨酸浓度的配制

取6个50ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5, 1.0,1.5,2. 0,2.5及3. 0ml, 用蒸馏水定容至刻度,摇匀,其每瓶的脯氨酸浓度分别为1,2,3,4,5,及6μg/ml/

(3)取6支试管，分别吸取2ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30分钟。

(4)冷却后向各试管准确加入4ml甲苯，振荡30秒钟，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

(5)用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520nm波长进行比色。

(6)标准曲线的绘制:先求出密度(y) 依脯氨酸浓度(x)而变的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线计算2ml测定液中脯氨酸的含量(μg/ml)。

2.样品的测定

(1)脯氨酸的提取:准确称了以不同处理的待测植物叶片各0. 5g,分别置大试管中，然后向各管分别加入5m13%的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提了以10分钟，( 提取过程中要经常摇动)，冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。

(2)吸取2ml提取液二另一干净的带玻璃试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚一桐试剂，在沸水浴中加热30分钟，溶液即呈红色。

(3)冷却后加入4ml甲苯，摇荡30秒钟，静置片刻，取上层液至10ml离心管中，在3000μm下离心5分钟。

(4)用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，在分光光度计上520nm波长处比色，求得光密度。

(三)结果计算

根据回归方程计算出(或从标准曲线上查出) 2ml 测定液中脯氨酸的含量(Xμg/2m1)，然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下:

Xx5/2x100

脯氨酸含量(%)=

样重x10⁶

⑧ 氧自由基产生速率的测定:

模拟酸雨对照实验，共三组（对照组，酸雨组，酸雨 镧络合物组），确定镧络合物浓度、酸雨pH

（一）材料、仪器设备及试剂

1. 材料：花生、绿豆、大豆黄化幼苗的下胚轴及其他植物叶片。

2. 仪器设备：高速冷冻离心机；分光光度计；恒温水浴锅；研钵；试管；移液管；试管架；移液管架；洗耳球等。

3. 试剂配制：

50 mmol·L－1 磷酸缓冲液（pH7.8）

1 mmol·L－1 盐酸羟胺

17 mmol·L－1 对氨基苯磺酸（以冰醋酸：水= 3 ：1配制）

7 mmol·L－1 α－萘胺（以冰醋酸：水= 3 ：1配制）

50nmol·ml－1 NaNO2母液

（二）实验步骤

1. 提取液制备称取1g植物叶片放入冰浴的研钵中，加入50mmol·L－1 磷酸缓冲液（pH7.8）5ml, 研磨成匀浆，在1000r/min，4℃下离心10min，取上清液再以15000r/min，4℃下离心20min，第二次上清液即为样品提取液。

2. 亚硝酸根标准曲线的制作

2.1 系列浓度NaNO2溶液的配制取50nmol·ml－1 NaNO2母液，分别稀释成0、10、20、30、40和50、nmol·ml－1 的标准稀释液。

2.2 取7支试管，编0～6号，分别加10、20、30、40、50、nmol·ml－1NaNO2标准稀释液1ml，0号管加蒸馏水1ml，然后各管再加50mmol·L－1 磷酸缓冲液1ml，17 mmol·L－1 对氨基苯磺酸1ml和7 mmol·L－1 α－萘胺1ml，置于25℃显色20min后，以0号管作空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。

2.3 标准曲线绘制以1～6号管亚硝酸根（NO2－）浓度为横坐标，吸光度值作纵坐标，绘制标准曲线。

3. O2－含量测定

取4支试管，编0～3号，1～号管分别加入样品提取液0.5ml（三个重复），0号管加蒸馏水0.5ml，然后各管加入50mmol·L－1磷酸缓冲液0.5ml，1 mmol·L－1 盐酸羟胺1ml，混匀，置于25℃1 h后，各管再加入17 mmol·L－1对氨基苯磺酸1ml和7 mmol·L－1 α－萘胺1ml，混匀，置于25℃显色20min，以0号管为空白对照，在530nm波长处测定吸光度（A）值。

4.结果计算

根据所测得的A530值，从标准曲线上查得样品中NO2－浓度，按公式（1）即可计算出样品中NO2－浓度。然后依据羟胺与O2－的上述反应，从NO2－对O2－进行化学计量，按公式（2）计算，即将按公式（1）计算得到的NO2－浓度乘2，得O2－浓度。也可根据被测样品与羟胺反应的时间和样品中蛋白质含量，按公式（3）求得O2－的生产率。

NO₂-含量(nmol·g^-1Fw)= …………(1)

将所得NO₂-含量代入下式计算，即求出O₂-含量。

O₂-含量=NO₂-(noml·g^-1Fw)×2………………………………………………(2)

将公式(2)所得O₂-浓度及样品中蛋白质含量，依下式计算出O₂-产生速率。

O₂-产生速率(noml·mg^-1蛋白·min^-1)=…………(3)

⑨ 细胞质膜透性的测定:

模拟酸雨对照实验，共三组（对照组，酸雨组，酸雨 镧络合物组），确定镧络合物浓度、酸雨pH

一、材料、仪器设备

1.材料：植物叶片

2.仪器设备：电导仪；电子天平；冰箱；真空泵；真空干燥器；恒温培养箱；电炉；50m1

烧杯；5σm1量筒；小镊子；纱布；表皿；滤纸条；镜头纸；剪刀；玻棒；胶头滴管；瓷盘

二、实验步骤

1.清洗用具

所用玻璃用具均需先用洗衣粉清洗，然后用自来水、蒸馏水洗3次，干燥后备用。

2.实验材料的准备及处理

选取叶龄相似的植物叶片，剪下后用湿布包住。实验时用自来水将供试叶片冲洗，除去

表面沾污物，再用蒸馏水冲洗1~2次，用干净纱布轻轻吸干叶片表面水分，然后剪成约1cm的小叶片(或用直径为1的打孔器钻取小园片)，注意除掉大叶脉。将剪下的小叶片混合均匀，快速称取鲜样三份，每份1g，分别放入编号为A、B、C的三个烧杯中。作如下处理：

A杯放入冰箱0℃以下作低温处理，处理15~30min后取出(供试叶片也可以在实验前低

温处理好待用，处理温度及时间依不同植物叶片耐寒性而定)，加入蒸馏水50m。

B杯常温处理，加入蒸馏水50m1

将A、B二杯放入真空干燥器，用真空泵抽气20-30min(以抽出细胞间隙中的空气)，

然后缓缓放入空气，从真空干燥器中取出A、B杯。

C杯加入蒸馏水50m1，称重，盖上表皿，置于电炉上煮沸10~15min(煮沸时间依不同

植物叶片而定)，冷却后再称重并加蒸馏水至原重量，继续浸泡叶片。

将A、B、C三杯放置室温下浸提1h左右(经常摇动，以有利电解质外渗)。然后将叶

片从杯中夹出进行下一步测定

3.电导率测定

用电导仪分别测定A、B、C三杯的电导率，同时测定蒸馏水(空白)的电导率(注意：

每测定完一个样液后，用蒸馏水漂洗电极，再用滤纸将电极擦干，然后进行下一个样液的测

定)，所测得的结果记入下表

电导率测定记录表

三、结果计算

按下列公式计算低温及常温处理电解质的相对外渗率：

4. 参考文献

[1金琎，叶亚新，夏正祥.镧对酸雨胁迫下敏感植物幼苗的影响[j].湖北农业科学,,2010，（4）：93-96.

[2]张海艳.模拟酸雨对不同类型玉米种子萌发和幼苗生长的影响[j].应用生态学报，2013，24（6）：1621-1626.

[3]边才苗,王锦文.lacl3对辣椒种子酸雨胁迫的缓解效应及其评价[j].中国稀土学报,2011,29(3)：371-376.

5. 计划与进度安排

（1）2022-2022-1学期17-19周及2022-2022-2学期第1周-第3周（2022-12-23~ 2022-3-13），查阅资料和文献，准备开题报告，外文论文翻译；

（2）第4周-第8周（2022-3-16~ 4-17），浸种，培养实验材料，摸索实验方法；

（3）第9周-第12周（2022-4-20 ~ 2022-5-15），培养植物幼苗，确定实验方法，确定酸雨及镧络合物的施用方法及浓度，测定生理指标；