拟南芥PID激酶功能的初步研究开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

生长素一直是植物学研究的热点。19世纪德国植物学家julis von sachs提出一个假设, 在高等植物体内存在移动的化学信号参与调控植物的代谢、生长和形态建成。19世纪下半叶, charles darwen和他的儿子francis darwen研究了植物的向光生长, 推测产生于胚芽鞘顶端的某种信号被向下运输到生长区从而引起背光侧比向光侧生长迅速, 产生向光的生长。随后, frits went 在1926 年证明了燕麦胚芽鞘尖端存在促进生长的化学物质, 他把这种物质命名为auxin, 这是取自希腊语auxein, 意思是to grow。因此, 中文将auxin翻译为生长素。直到20世纪30年代, 人们才确定生长素是吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid, iaa)。生长素广泛存在于所有植物中，在植物生长发育过程中扮演着重要角色，如顶端优势、花序和叶序的发育、胚的发育、主根的发育、侧根和不定根的发生、向性生长以及维管组织的分化等。这些过程都依赖于生长素浓度梯度的建立。生长素的浓度梯度是由生长素的合成和极性运输共同建立的。生长素的极性运输是生长素所特有的一类从细胞到细胞的主动运输。传统意义上的生长素极性运输是指生长素从植株的茎尖生长点和幼叶等组织向下部组织的单向运输。近十几年来，对生长素的极性运输有了更深入的研究，已知植物中不仅存在着从茎尖向根的极性运输，还具有在组织局部的极性运输。例如，在根尖存在着生长素的环流，从地上部分通过维管组织运输来的生长素经过根尖中柱细胞间的单向运输，向根尖静止中心聚集，然后又通过表皮细胞和侧根冠细胞向根尖的伸长区运输，再通过皮层细胞向根尖分生区回流。生长素发挥调控作用，主要是通过在植物组织或器官建立不对称分布，生长素的极性运输在生长素浓度梯度的建立和维持中具有重要的作用。生长素极性运输依赖于内输载体auxin resistant1/like aux1(aux/lax)家族、外输载体pin-formed(pin)蛋白家族和atp-binding cassette sub-family b/p-glycoprotein (abcb/pgp)蛋白家族。pin蛋白家族是一种公认的生长素输出载体，它们在细胞膜上呈极性分布，负责将生长素从胞内运输到胞外。20世纪90年代，对拟南芥pin-formed1突变体的研究表明，pin蛋白在生长素从细胞输出中发挥作用。近年来的研究显示，pin蛋白与植物的许多生理过程也有密切关系。

盐胁迫是植物体经常遭受的非生物胁迫之一，在世界范围对作物生产会造成重大损失。研究植物感受、应答高盐胁迫的分子机制将有助于选育抗逆作物品种（carlos等，2013）。近些年研究表明，植物磷脂酶d（phospholipase d，pld）是植物耐盐胁迫信号中的重要组成部分（bastiaan 等，2009）。pld是植物中主要的磷脂酶，能够催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应，在囊泡运输、膜的降解和细胞内信号转导等途径中有重要的作用（testerink和munnik，2005；wang，2005）。研究发现，pld可以提高植物对胁迫的抵御能力，如机械损伤、冷害、植物-病原物相互作用、脱水及盐害（welti等，2002）。pld的水解产物磷脂酸（pa）作为第二信使参与细胞内信号转导过程（bastiaan 等，2009）。pa可以结合多种蛋白，包括转录因子、激酶、磷酸酶、参与中心代谢的酶以及参与囊泡运输和细胞骨架重排的蛋白（testerink 等，2004；zhang等，2004；jang等，2012）。研究表明，pa结合蛋白并调节靶蛋白的活性，使蛋白锚定在质膜，促进蛋白复合物的稳定性及其功能的发挥作用。（nishikimi等，2009；jang等，2012)。

当植物遭遇盐胁迫时，体内pld活性升高，产生的pa结合蛋白并将其锚定到细胞膜，从而行使功能，抵御盐害（testerink和munnik，2011；mcloughlin等，2013）。已有研究发现，pa可以结合丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶pinoid（pid）（gao等，2013）。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶pinoid（pid）和蛋白磷酸酶2a（protein phosphatase 2a，pp2a）调控pin蛋白（生长素输出载体，pin-formed）在细胞膜的极性分布（顶端或底端），二者起拮抗作用，pid过表达或pp2a缺失会导致pin的细胞顶端定位；pid功能缺陷会使pin在细胞底端定位（benjamins等，2001；friml等，2004；michniewicz等，2007；adamowski和friml，2015）。研究发现，pin1蛋白中央亲水环内保守的丝氨酸位点能被pid磷酸化，将该位点定点突变为glu/asp或者ala，模拟磷酸化或去磷酸化能分别使pin1蛋白定位在顶部细胞膜或者底端细胞膜（huang等，2010；zhang等，2010）。另外，pin2蛋白在膜的极性分布是动态的。当拟南芥幼苗遭遇高盐胁迫时，pld活性升高，会刺激网格蛋白介导pin2发生内吞作用，引起pin2不对称分布，促使生长素重新分布，最终导致根发生弯曲（galvan-ampudia等，2013）。

2. 研究的基本内容和问题

（一）研究目标

1）用分子生物学方法确定pid激酶磷酸化pin2蛋白，且活性受到pa的影响；

2）利用分子生物学方法确定盐胁迫下pid激酶活性发生变化，pin2磷酸化水平升高。

3. 研究的方法与方案

（一）研究方法和技术路线

盐处理拟南芥幼苗，pld活性被激活，产生pa，pa可以与蛋白激酶pid结合，并提高pin2蛋白磷酸化水平，使生长素分布发生变化，从而影响根发育。

技术路线如下图：虚线部分是我们要解决的问题。

4. 研究创新点

发现磷脂酸PA通过结合并提高PID活性进而激活PIN2转运生长素的新通路。

5. 研究计划与进展

2017/10-2018/1 克隆pid与pin2基因，构建其gst标签载体，转入bl21，表达蛋白；通过激酶分析实验，确定pid激酶磷酸化pin2蛋白并受到pa的影响。

2018/2-2018/4 nacl处理后，与野生型相比，观察pld中pid激酶活性变化以及pin2蛋白磷酸化水平变化。

2018/4-2018/6 查看文献，补充实验；整理实验数据，撰写论文。