新型四环素失活酶作用机制研究开题报告

全文总字数：3842字

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、研究背景：

抗生素自发明以来一直在抵抗感染性疾病方面作出巨大的贡献。它以使用方便，价格低廉，副作用小等优点被广泛运用于养殖业和现代医疗中 [1，2]。 但人类干预对微生物圈产生了巨大影响， 本身环境中的抗生素可以逐渐降解， 携带耐药基因的元件可以自身复制并稳定保存， 这是正常的自然循环。原本耐药决定簇都是在低浓度抗生素选择条件下通过代谢，结构和信号传导的方式被选择下来的。 而人类对抗生素的使用则打破了这种局面， 随着抗生素类药物被滥用， 使得致病菌和共生菌都受到更高浓度的抗菌药物和压力，加速了包括病原菌在内的微生物群体抗生素耐药性的进化以及传播，导致多重耐药菌株的产生 [3，4]。多重耐药菌株不断出现，使抗生素寿命越来越短，这个现象一是令我们警惕不要滥用抗生素，二是令我们认识到我们对微生物的探索还远远不够。在旧抗生素不断被打败的过程中，几种新抗生素被发现，其中的四环素类抗生素是一类广谱抗生素，因价格低廉、副作用小而应用最为广泛，在临床上及动物养殖业上发挥了巨大作用。但随着使用量的增加，四环素耐药性也在临床菌中迅速传播，面临着和之前的几种抗生素几乎一样的问题。这些四环素耐药菌和耐药基因也随着人类活动而产生的垃圾、医疗废水及动物排泄物等途径大量进入自然环境，使得现阶段在土壤、食物、动植物体、河流、海洋等介质中均可大量检出四环素耐药基因。仅仅在土壤中，四环素类耐药基因就有 40 多种被检出，例如 tet(a)、tet(z)、tet(o)等，这些耐药基因能够在病原微生物和环境微生物之间发生基因的水平转移 [5，6]，创造出更多的多重耐药菌株，进而威胁动物与人类的健康。在以往，绝大多数研究倾向于将耐药性当作细菌针对特定抗生素产生的特异性现象来研究，然而近年来研究发现大部分病原菌获得的耐药基因均来源于自然环境，并且在生态环境中其功能不同于与它们在临床上的表现。由此可见，即便是在抗生素生产菌中，也不能确定耐药基因的原始功能就是帮助对抗其自身生产的抗生素。例如mdr外排泵(multi-drug efflux pumps)存在于所有细菌中，它们除了耐药性之外，还参与到细菌毒力、维持体内稳态以及细胞内代谢产物解毒等其他功能中。这反映了耐药性并非耐药基因的特异性功能，这些研究为耐药基因的研究提供了新的思路。

2. 研究的基本内容和问题

解决问题：本课题拟通过对表达载体、宿主及表达条件的摸索，提高环境来源的新型四环素钝化酶基因的表达量，并对其体外活性进行确证，及其作用机制的初步探索。

3. 研究的方法与方案

1、本课题拟采用不同pet表达载体将找到的环境来源的新型四环素失活酶基因进行异源表达；

2、收集产物后，采用his-tag柱纯化产物，得到具有一定浓度的目的蛋白；

3、对获得的纯化酶进行功能确证，及作用机制的初步探索。

4. 研究创新点

环境微生物来源的基因由于遗传背景特异，异源表达困难。本课题拟通过对表达载体、宿主及表达条件的摸索，提高目的基因的表达量。

5. 研究计划与进展

2019.1-2019.2 目的基因的克隆，与表达载体的连接。

2019.2-2019.5 目的基因的异源表达及优化。