碳量子点和金属量子点对微藻小球藻的毒性外文翻译资料

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碳量子点和金属量子点对微藻小球藻的毒性

摘要

在本实验中，我们分别研究了两种量子点在不同浓度下对微藻小球藻的细胞毒性：碳量子点和金属量子点。其中，碳量子点有N,S修饰的碳量子点（N,S doped CQDs)，N修饰的碳量子点(N doped CQDs)，未加修饰的碳量子点(no doped CQDs)三种；金属量子点有CdTeQDs,CdSQDs,CuInS2/ZnS QDs三种。我们通过测定海藻的生长抑制，急性毒性试验半最大效应浓度(EC50)，叶绿素a含量，蛋白质含量，抗氧化物酶活性和代谢物含量来比较不同量子点对小球藻的毒性。本实验中用不同浓度的量子点对小球藻进行处理，其中叶绿素a的含量和海藻细胞数量保持一致，这说明了其具有很好的剂量依赖关系。在第96小时，N,S doped CQDs,N doped CQDs,no doped CQDs，CdTeQDs,CdSQDs,CuInS2/ZnS QDs的EC50分别是38.56,185.83,232.47,0.015,4.88,459.5mg/l。从而说明，这几种量子点的毒性大小依次是：CuInS2/ZnS QDslt;no doped CQDslt;N dopedCQDslt;N,S dopedCQDslt;CdS QDslt;CdTeQDs。随着量子点浓度的增加，抗氧化物酶SOD活性随之增大，而非酶性的抗氧化剂谷胱甘肽活性随之下降。当海藻暴露在量子点处理时，由活性氧刺激导致细胞发生脂质过氧化反应的产物丙二醛的含量也上升。总之，碳量子点的毒性小于金属量子点的毒性；但是这六种量子点中CuInS2/ZnS QDs的毒性是最小的。

1.引言

作为荧光纳米材料，许多有着独特特性的量子点被大量制造并且广泛地使用。其中量子点主要分为金属量子点和碳量子点。许多种金属量子点已经运用于生物医药材料和工业产品，包括图像传感器，LED灯里的发光材料和太阳电池等。碳量子点在细胞标记，生物成像和其他领域等有很大的前景。由于含量子点的工业产品持续增多，大量的纳米材料被释放到环境中，它们最终留在环境中的可能性很高。当它们进入水生生态系统时，它们对水生生物群体的作用还未可知。因此有关于量子点对水生生物的影响的文献越来越多。据研究表明，一些金属量子点在水环境中可以部分降解并释放出游离Cd² ，造成比当量浓度的溶解Cd² 更大的毒性。到目前为止，几乎没有研究是关于量子点对淡水微藻类和海洋生物的影响的。

作为初级生产者，浮游植物在水生生态系统中扮演了重要的角色。其中，微藻类对污染物十分敏感，潜在的环境问题会降低其初级生产力，进而对整个食物链造成影响，进一步可能改变整个生态系统的结构和功能。微藻类很容易培养和繁殖，并且广泛存在于江河湖海中。因此，微藻类是很好的模式水生植物。最近，Zhou对CdSe/ZnS QDs在四种微藻类上产生的毒物学作用进行了研究，通过对浮游生物的不同生物学参数进行分析，进而对量子点在海洋环境上的影响进行描述。

本篇文章的目的是对不同类型的量子点作用于浮游生物产生的毒性效果进行评估。我们根据所测的生物学参数来反映不同类型量子点的毒性作用。在这里我们利用小球藻作为模式生物，评估了六种量子点的毒性作用。通过测定海藻的生长抑制，急性毒性试验半最大效应浓度(EC50)，叶绿素a含量，蛋白质含量，抗氧化物酶活性和代谢物含量，我们可以描述不同量子点对小球藻的毒性。在此之前没有相似的研究，我们采用实验室自己合成的六种量子点，分别评估其对淡水小水藻产生的毒性，同时使用相同的指标参数对六种量子点的毒性作用进行比较。

2.材料和方法

2.1 材料

实验对象小球藻由中国科学院水生生物研究所提供。小球藻在无菌的条件下，培养在装有150ml灭菌的BG-11培养基的250ml锥形瓶中。BG-11培养基包括下面的化学成分（mg/ml）：硝酸钠，1500；磷酸氢二钾，40；七水合硫酸镁，75；氯化钙，36；碳酸钠，20；EDTA-Na₂，1；柠檬酸铁铵，6；柠檬酸，6；硼酸，2.86；氯化锰，1.81；七水合硫酸锌，0.222；钼酸钠，0.39；硫酸铜，0.079；硝酸钴，0.0494。小球藻需定期地接种到BG-11培养基中，以保证里面的细胞处于对数生长期，并且为后续的实验做准备。所有的锥形瓶都在121℃灭菌30分钟。培养的条件如下：光照强度 4000lx，光照/黑暗时间=1：1，温度25plusmn;1℃，人工间歇摇晃，一天两次，以保持对数生长。实验过程中使用的水是去离子水。

本实验中使用的量子点是我们实验室自己合成的。其中N，S doped CQDs，CdS QDs的具体合成方法将会发表在别一篇文章里。N doped CQDs，no doped QDs，CdTe QDs，CuInS2/ZnS QDs的合成方法在之前的文章有记载。所有制备好的量子点真空干燥零度保存用于之后的实验研究。

N,S doped CQDs,N doped CQDs,no doped CQDs, CuInS2/ZnS QDs(10,000mg/l)的母液根据下面方法准备：称量1000mg 量子点粉末，将其用去离子水溶解在100ml锥形瓶中，调整它的pH到7.0，将其保存在零度。CdTeQDs(20 mg/l)和CdSQDs(1500mg/l)母液的配制同上述方法。

2.2 细胞密度的测定

将小球藻按一系列的细胞密度接种在新鲜的培养基中。使用改进的血球计数板对细胞数目进行测定，该方法相当于在680nm波长下利用紫外可见分光光度计进行光密度计算。根据测量获得的光密度数据进行绘图可获得线性方程。

2.3 小球藻的生长抑制分析

2.3.1 小球藻的生长

在进行了充分的预实验之后，我们将实验用的小球藻最终细胞密度设置为2.5106 cell/ml，小球藻暴露培养于一系列浓度梯度的N,S doped CQDs(0，1,5,10,50,100mg/l),N doped CQDs(0,5,10,50,100,500mg/l), no doped CQDs (0,5,10,50,100,500mg/l),CdTeQDs(0,0.01,0.02,0.1,0.2,1mg/l),CdSQDs(0,0.75,1.5,7.5,15,75mg/l),CuInS2/ZnSQDs(0,10,20,100,200,1000mg/l),每个浓度做三次重复。利用UV-752对细胞密度进行检测。小球藻生长抑制率是量子点的毒性指标之一。

2.3.2 半最大有效浓度EC50

碳量子点和金属量子点的量效曲线是利用细胞计数器在对小球藻培养6天之后建立的。实验条件和2.3.1的相同。在0 h,24h,48h,72h,96h,120h,144h对细胞密度进行测量。毒性反应定义为由实验物质导致的生长速率的相对下降所体现出的生长抑制，公式为：

（N₀是理论的初始细胞密度，N_n是测量的最终细胞密度，t_n是时间间隔。）

对每个检测浓度的抑制百分率I进行检测，公式为：

（I_ui是测定浓度i组的抑制百分率（生长速率），mu;_i是测定浓度i组的平均生长速率，mu;_c是控制组的平均生长速率。）

每个响应检测物的量效曲线都是利用I_mu;i和检测浓度一一对应绘图所得。EC50是在抑制率为50%时所对应的检测浓度。

2.4叶绿素a含量

叶绿素a的提取方法如下：取10ml的海藻悬浮液放入塑料离心管中，在1300g离心15分钟，然后弃上清。加入10ml 95%的乙醇，将离心管置于60℃水浴加热5分钟，接着1300g离心10分钟。提取上层清液，用UV-752在652nm和665nm下检测吸光值。叶绿素a的含量用如下公式进行计算：

2.5 蛋白质含量

利用Bradford方法，选用BSA作为标准参照，在595nm下可以量化蛋白质的含量。蛋白质的提取过程如下：在第144小时收集10ml的海藻悬浮液，在1300g，4℃离心15分钟，然后弃上清。迅速向各管中加入磷酸缓冲液（pH7.4，100mM），将其置于超声破碎仪中冰浴破碎20分钟（频率设置75%，破碎2秒，间隔2秒），匀浆在1300g，4℃离心15分钟。蛋白质含量的测定在南京建成生物工程研究所完成。

2.6 酶活性和代谢产物

SOD被认为是酶促抗氧化剂，利用NBT光化还原法对其活性进行检测。SOD的活力单位定义为1ml反应液中产生50%亚硝酸盐抑制的酶的数量。GSH被认为是非酶促抗氧化剂，利用DNBT法对其含量进行测定。MDA作为体外脂质过氧化的标志，利用TBA法对其含量进行测定。SOD，GSH，MDA的提取方法同补充2.6部分，测定也在南京建成生物工程研究所完成。

2.7 数据分析

运用Origin8.0(OriginLab,Northampton,MA,USA)对数据进行分析。运用IBM SPSSS tatistics 19 进行统计分析。(Plt;0.05)

3.结果和讨论

3.1 六种量子点对藻类生长的影响

图一显示的是在六种不同浓度的量子点的作用下，小球藻的生长曲线。表一显示的是碳量子点和金属量子点对小球藻平均生长速率的影响。根据图一显示，在144小时（6天）里，低浓度的量子点处理下，海藻的生长密度和对照组相近。然而，高浓度的量子点处理对海藻生长产生了消极影响，并且显著地抑制了细胞生长。从表一可以看出，随着量子点浓度的增加，小球藻的平均生长速率逐步下降。

3.2 六种量子点的半最大效应浓度分析

碳量子点和金属量子点的半最大有效浓度是通过生长抑制对藻类细胞进行计数来测定的，结果显示在表二a，b中。如表二a所示，三种碳量子点对小球藻的半最大有效浓度随着暴露时间的延长而增大，这意味着这三种碳量子点的抑制作用随着暴露时间的延长而下降。关于这个现象，有两种解释：

1）大部分的海藻被毒死了，但是剩下的活细胞可以进行自我修复并且产生抗性，继而可以在碳量子点暴露下重新恢复生物量。

2）碳量子点是用有机物合成的，因此海藻对其具有代谢的能力。

从实验可以看出，这几种量子点的毒性大小依次是：CuInS2/ZnS QDslt;no doped CQDslt;N dopedCQDslt;N,S dopedCQDslt;CdS QDslt;CdTeQDs。我们实验室的早期研究表明，低浓度的碳量子点对铜绿微囊藻的生长有显著的作用，而且它们的毒性远远低于金属量子点。许多研究表明碳量子点对植物和哺乳动物细胞的生物毒性比金属量子点的低。我们的结果和这些早期的研究结果一致。而且，作为一种金属量子点，CuInS2/ZnS QDs有着低于碳量子点的生物毒性。这个现象十分重要，因为CuInS2/ZnS QDs 的毒性几乎没有被观测到，同时它还证明了不是所有的金属量子点都比单一元素的量子点毒性高。

量子点对藻类毒性的作用机制如下：

1. 量子点诱导细胞产生活性氧，从而导致细胞受到氧化损伤；
2. 量子点释放其核心金属到水中；

3）一些量子点具有表面修饰，毒性来源于其表面掺杂的物质。

碳量子点的毒性来源可能是来源于其表面掺杂的物质，金属量子点可能释放其核心金属元素到水中，而释放的金属离子对于水生生物是有毒的，即使在相对低的浓度下也是有毒性。其中，CdTeQDs和CdSQDs的毒性主要归因于其核心金属Cd。逐步应力模型SSM表明，随着有毒物浓度的增加或者暴露时间的延长，生物体一系列的反应会逐渐激活。CdTe QDs和CdS QDs的具体合成过程是不一样的，其合成所用的元素也是不一样的，因而二者的毒性可能有显著的区别。而合成CuInS2/ZnS QDs的元素都是低毒性的材料，因而其毒性比较小。

3.3 六种量子点对小球藻叶绿素a含量的影响

图三显示的是，碳量子点和金属量子点在0h，48h，96 h,144h对叶绿素a含量的影响。不同浓度的碳量子点和金属量子点对叶绿素a含量的影响和对海藻生长影响的趋势一致。海藻的叶绿素a含量下降是一个很普遍可观察到的毒性现象。有以下两个原因：

1）量子点的毒性导致海藻的叶绿素a合成能力下降

2）大部分破碎的细胞是利用显微镜观察的，因而叶绿素降解的速度增加。

144小时内，post-hoc两两比较检验被用来比较不同组之间的区别。结果表明，和对照组相比，不同浓度不同种类的量子点对小球藻叶绿素a的含量有不同的影响。主要体现在不同浓度的量子点的作用不同，其中，高浓度的量子点的抑制作用更强。浓度最高的量子点比其他组相较于对照组差异更显著。

3.4 六种量子点对小球藻蛋白质含量的影响

图四显示的是，碳量子点和金属量子点在144小时对小球藻蛋白质含量的影响。随着量子点浓度的增大，蛋白质的含量减少。这个变化趋势和叶绿素a含量变化一致，因为蛋白质是光合作用的产物之一。两两比较检验被用来比较不同组之间的区别。结果显示，和对照

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