在大气气溶胶中通过类腐殖质物质调节活性氧的产生外文翻译资料

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在大气气溶胶中通过类腐殖质物质调节活性氧的产生

摘要：悬浮颗粒物（PM）——通过PM所构成的介导活性氧产物（ROS）已经被涉及到对健康的影响了。类腐殖质物质（HULIS）是一种来自大气气溶胶颗粒或者从云雾降水样品中分离出来的，能从有机化合物中榨取水分的未分解混合物。在本研究中，我们使用无细胞的二硫苏糖醇（DTT）分析方法去衡量被HULIS介导的ROS产品。HULIS样品是分离自珠江三角洲农村和郊区所采集的气溶胶。在我们的实验中，被微量HULIS中残留的金属离子所激活的ROS在DTT分析中被一种强大的螯合剂所抑制。在DTT消耗不超过90%的情况下，DTT的HULIS催化氧化遵循关于DTT浓缩的零级动力学原理，并且DTT的氧化比率正比于HULIS的剂量。HULIS气溶胶中的ROS活性，在每单位的质量基准为2%情况下ROS活性被醌物质，1，4-萘醌干涉并且超出了两种水生富啡酸。被测定的展示的环境样品中的微量HULIS与有机溶剂榨取出的微量成分对ROS的活性做比较，其中含有某种物质比如醌，一种已知的有机化合物类能催化细胞中活性氧的能力。HULIS被发现是PM中主要的可以用水萃取的氧化还原活性组分。合理的说，HULIS包含可逆氧化还原点，从而作为电子载体形成ROS。我们的研究表明HULIS可能成为在生成的ROS中成为活性PM成分，进一步的研究是保证其氧化还原性的特点。

前言：大气颗粒物（PM）在流行病学研究中已被证实能对健康造成不良影响。在受影响的细胞里面，大多数PM所导致的不良健康影响都与来自介导活性氧产物（ROS）的氧化压力有关。ROS是有强氧化能力的含氧物质，主要包含超氧化物阴离子(O2bull;)，氢氧自由基(bull;OH)，过氧化氢(H2O2)，和其他过氧化物。大量的研究表明，环境颗粒物和柴油废气颗粒物能催化ROS的产生。然而在常识范围内，PM中的化学物质对ROS的产生原由非常不充分，这是由于我们对PM的化学组成的认识十分有限，尤其是那些组成PM有机组分的无数的有机成分。

在众多PM的组分中，金属和醌的成分已经被证实使能够在细胞里面催化ROS的生成。最近的一项研究表明绝大多数柴油机尾气粒子的有机提取物中的ROS活性与类醌物质有关。可电离的金属可以通过催化芬顿反应类型调节ROS的形成，然而醌成分能够作为催化剂传送来自细胞里生物还原当量（如NADPH或者抗坏血酸）的电子，能够溶解氧和导致连续产生超氧化物阴离子和过氧化氢。

类腐殖质物质（HULIS）已被公认为是一类在大气颗粒物中含量丰富的水溶性有机颗粒物，在中国南方的农村地区，我们的检测表明HULIS包含60%的水溶性有机碳（WSOC）。大气颗粒物中的HULIS与陆生和水生腐殖质（HS）在结构特性上有很大的相似之处，即使在常见官能团的相对碳分布上仍有区别（e.g.，羧基，羰基，羟基，芳香族，脂肪族，etc）。水生HS被认为在水栖生物体中具有生物反应性。一些研究已经证明了那些能溶解的HS能引起淡水生物体的氧化压力。然而，空气污染健康研究所很少研究HULIS。

在本研究中，二硫苏糖醇（DTT）分析法被用于测定被HULIS介导的ROS产品。HULIS样品是分离自珠江三角洲农村和郊区所采集的气溶胶。DTT分析，一种由Kumagai等人研发的，基于氧化还原的化学分析法，定量催化氧化还原物质。DTT所扮演的角色就如同细胞里面的NADPH或者抗坏血酸。图片1说明了有机成分介导ROS产生和DTT伴随消耗的感官概念图。由于过量DTT的存在，DTT的消耗速率正比于样品中的氧化还原物质的催化活性（e.g.，醌）。李等人演示了通过PM样品，在试管中定量测定以DTT为基础的化学反应活性对ROS的催化形成。他们应用这种DTT去分析柴油机尾气和环境中的PM样品，并且观察了DTT分析结果是与细胞血红素（HO-1）的表现有关联，一种氧化压力的敏感符号。其他许多的研究人员也同样运用DTT分析法去确定PM介导ROS的形成。

图片1：HULIS介导ROS产生和DTT伴随消耗概念图

实验部分

气溶胶取样 在此次操作中使用了十份PM2.5（空气动力学直径小于2.5微米的大气颗粒物）的样品。其中5份样品取自阳春市的郊区，另外5份取自广州南沙居民区。使用大容量的气溶胶采集器把样品采集进烘干石英过滤器。单个样品的采样时间20小时到36小时。所有的样品（除了NS070916）都是取自1月和11月之间，时间上与当地农作物收获时间一致，期间作物残渣的燃烧能被直接观察到。我们的化学分析也确定了生物质燃烧的影响。K 和 K /

EC（元素碳）的浓度比率比非收获季节高出了5至6倍。关于取样工作的的更多细节可以在以前的论文中找到。

除去总质量中的HULIS部分，我们并不了解官能团的组成或者元素的组成，更别提那些HULIS的分子水平组成了。信息上的缺乏使进一步了解ROS活性与HULIS的联系变得困难。相反，在更大的样品集里进行ROS活性分析的价值就变小了。本研究想要说明大气中HULIS生产ROS的潜力以及消除这种量级下的潜力对氧化还原物质的干涉。为此，我们在此研究中把实验限定在10份取自两种不同大气环境中的样品，为的就是得到具有统计意义的结果。

HULIS的分离和确认 使用固相分离技术(SPE），通过蒸发光散射器（ELSD)的量化，在水提液中把气溶胶过滤样品中的HULIS与其他物质分离。这种分离过程能把水溶性物质分离进亲水性有机物（SPE墨盒废水）和憎水性有机物（i.e.，HULIS或洗出液）。特征细节和方法性能在之前的工作中已经提到过了。简而言之，在超声波清洗器中用水提取大容量过滤样品的一部分。过滤样品面积水容积的比率大约是1 cm2 /mL。取一份整10ml的样品，在放入SPE之前用HCL酸化至PH为2。通过SPE的分离过程，在PH为2的情况下被质子化的芳香环化合物和多极性官能团都保留在了SPE的吸附剂上。强亲水性物质，如主要的无机物离子（e.g.，K ，Na ，NH4 ，Mg2 ，Ca2 ，Cl-，NO3-， 和SO42‑），低分子量的有机酸和糖类化合物（e.g.，左旋葡聚糖，木糖和蔗糖）通过SPE盒子并出现在分馏物中。在装盒被两份1ml的水清洗之前先用甲醇洗脱。这次SPE过程的废水和洗出液被分别收集。洗出液在温和的氮气气流下被蒸发干燥至40摄氏度并再次溶解在5ml的水中，之后为了HULIS的量化将其注入ELSD。在我们先前的工作中，我们使用含2%氨水的甲醇作为洗脱溶剂是因为它的洗脱效率高（i.e.，1.5ml的甲醇胺几乎能洗掉SPE盒上面所有的HULIS）。然而最近的一项研究表明氨可能与实验室生成的二次气溶胶中的羰基化合物反应生成亚胺。这提示我们可以在洗脱溶剂用NH3检测HULIS化学成分的可变性。我们的实验表明当SPE协议中加入氨之后，NAFA溶液中DTT的反应性会增强，表示氨可能对HULIS进行了化学修饰。我们由此排除了SPE步骤中产生的洗脱溶剂中的氨。除此以外用于洗脱的甲醇的体积也增至12ml。12ml甲醇的洗脱效率是那些通过浓缩的1.5ml甲醇氨的84plusmn;8%（n=10）。我们之前的研究表明40%的碳含量来自馏分，而60%的碳含量仍留在HULIS中。

DTT分析 二硫苏糖醇（DTT），二乙三胺五乙酸（DTPA），1，4-萘醌（1，4-NQ），5,5rsquo;-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）均购买自SIGMA（圣路易斯，密苏里州）。北欧水生富啡酸（NAFA）和萨旺尼河富啡酸（SRFA）均取自国际腐殖质协会（圣保罗，明尼苏达州）。本研究中所使用的DTT分析方法过程主要遵循李等人所使用过的。 一份40mu;L的样品首先要与1ml含0.1毫克磷酸钾的缓冲剂（PH 7.40）在2ml小瓶中混合。有些DTT分析法是设计成用金属离子抑制DTT的消耗。在那些分析当中，往DTPA中加入磷酸盐缓冲剂使得最后的缓冲溶剂中包含1mM DTPA 。40mu;L一份的样品中包含98-214 ng/mu;L HULIS，或500 ng/mu;L水生富啡酸，或2.8 ng/mu;L 1,4-NQ。含0.5 mM DTT的50mu;L溶液随后加入，在温度为37摄氏度的烤箱中反应90分钟。含1.0 mM DTNB的100mu;L溶液（包含20mM DTPA）加入反应溶液中生成有色物质之后，用二极管矩阵分光光度计在410nm的条件下吸收（A）测量30分钟。DTT分析得出DTT消耗百分比可用下面的式子计算：

其中A0加入到以纯水作为空白样品中的DTT吸光度。在空白样品中，DTT只被溶解氧消耗。校准曲线证实了在我们的实验条件下，溶液中DTT的浓度与吸光度呈线性关系（相关系数gt;0.99）。空白样品是在相同的DTT分析步骤中被加工处理。在90分钟的保温之后，DTT的消耗仅仅是1.1plusmn;0.5% （n = 3）。在我们随后的试验中，所有的数据显示DTT的消耗小于1.6%（i.e.，平均值加标准差），被认为是没有了DTT活性。模型化合物，比如9，10-菲醌（9，10-PQ）和NAFA，通过同样的SPE协定加工处理，就如同用相同的DTT分析对HULIS的分离和提取。我们在这里选择9，10-PQ而不是1，4-NQ作为模型醌化合物去评估

SPE过程对ROS活性的影响，是因为后者具有热不稳定性并且在氮气流干燥之后表显出不良的恢复效果。发现在这两种模型化合物的作用下，ROS的活性不受SPE协定的影响。

图片2：在90分钟的培育时间里HULIS催化DTT的消耗与HULIS的剂量呈一次函数关系（a）

以及（b）的培育时间。误差线代表了一式三份测量的标准差。试验中所使用的HULIS

均取自编号NS090112的气溶胶样品。

金属离子的确认 使用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定气溶胶水提取物，污水和洗出液成分（i.e.，HULIS成分）中的金属离子浓度。检测出14种金属离子（V，Cr，Mn，Fe， Co，Ni，Cu，Zn，Ag，Al，Hg，Cd，Ba，和Pb）。它们的侦测限度为0.1（Cd）至4.3 ng/mL （Fe）。这些金属离子要么是该区域气溶胶中所富含的（e.g.，Al，Zn，和Pb），要么是已报告能在受体细胞中催化ROS生成的（e.g.，Mn，Fe，Co，Ni，和Cu）。

图片3：归一化指数比较氧化剂的产生（NIOG）那些含水生富啡酸的10份环境样品的值。

误差线代表了一式三份测量的相同样品的标准差。

结果与讨论

HULIS催化DTT的消耗 图片2（a）表明在此分析中90分钟的培育时间里HULIS催化DTT的消耗与HULIS的剂量呈一次函数关系。DTT的氧化速率与添加在培养液中的HULIS剂量呈线性关系。当DTPA存在时，反应速率要比没有DTPA的情况下慢33%。催化反应速率的不同可能与HULIS组分中出现的微量金属离子有关（详细讨论见下一节）。DTPA经常被用来当作金属离子螯合剂是归结于它具有与金属离子形成稳定配位化合物的强大能力。

图片2（b）表明HULIS催化DTT消耗的时间依赖性。在本实验中，在含有DTT的缓冲液中加入5.2mu;gHULIS并在37摄氏度的条件下培育15至700分钟不等。当DTT的消耗小于90%的时候对时间的依赖的线性的。换句话说，催化反应速率是恒定的，也就是说，当DTT的消耗没有超过90%的时候，这个反应对于DTT来说是个零级反应。在这些条件下，催化氧化DTT的速率正比于催化剂的浓度，也就是说，DTT的丰度使HULIS中的亚胺变得活跃。

为了比较从不同气溶胶样品或其他某些物质分离的得到的HULIS中DTT的活性，氧化剂产物的指标（IOG）可以用下面的方程得到：

式中t是指反应时间（min），m指的是目标分析物的质量（e.g.，HULIS，1，4-NQ，etc）（mu;g）。IOG的值将被规范化，以反对源于规范化IOG值（NIOG）的1，4-NQ的IOG值。

图片4：（a）气溶胶水提取液和废水中的金属浓度。（b）HULIS中残留的金属浓度。

误差线表示5份取自郊区网点的气溶胶样品的标准变化。

图片3表明10份环境HULIS样品的NIOG值的范围是0.011至0.025。按照定义，1，4-NQ的NIOG值为1。很明显HULIS是氧化还原物质并能催化ROS的产生。农村和郊区的样品有相似的NIOG平均值（0.016和0.019）。合并的农村和郊区HULIS样品的NIOG平均值为0.018plusmn;0.004。也就是说，在每单位质量的基础上，那些在珠江三角洲农村和郊区地带所采集到的环境HULIS样品在催化ROS生成方面的能力是作为参考的醌物质的2%左右。两种水生富啡酸（SRFA和NAFA）也用DTT分析法测试。它们的NIOG值分别是0.004和0.011。这个结果表明DTT分析测定的HULIS的氧化应激效果超过了那些水生腐殖质。李等人用DTT分析法测定了新鲜柴油排放样品和老化柴油颗粒样品中的ROS的活性，报告了它们各自的NIOG值分别是0.001

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