H2O2对高温胁迫小麦幼苗逆境指标的影响开题报告

1. 研究目的与意义

温度是影响植物生长发育的主要生态环境因素之一，适宜的温度对植物的生长繁衍具有重要的积极作用。而高温是指超过植物生长最适温度以上的温度，对植物生长乃至生存均有负面影响。由于植物处于多变的环境中，许多植物都会遭受高温胁迫。农作物在生育期内遭遇短暂或持续高温胁迫将会对植物体产生一系列的伤害,诸如形态异常、生理生化变化等,进而影响植物的生长和发育。研究高温对植物生理特性的影响已经成为一个全球性的课题。

小麦是世界上仅次于玉米的第二大粮食作物，同时也是我国最主要的粮食作物之一，其丰欠程度直接影响到我国人民的生活水平和国民经济发展。小麦属于喜凉作物,其最适生长温度为15～20℃，生长过程中遭遇高温逆境胁迫将严重影响小麦的产量并降低其品质。高温胁迫会影响小麦的光合效率；高温胁迫会诱导活性氧产生，而活性氧会破坏细胞膜并损伤活性氧清除系统机能；高温胁迫会加速叶绿素和类胡萝卜素等植物重要光合器官的降解，使光合作用减弱。研究小麦的高温伤害以及其生理生化指标的变化规律，有助于采取相应的措施来减轻高温对小麦的伤害。

h₂0₂是动植物细胞代谢过程中产生的一种活性氧(ros)，在生物体内非常活跃，可与核酸、蛋白质、膜脂等生物分子反应。一方面，过多的h₂0₂会对细胞造成氧化损伤；另一方面，大量的研究证明h₂0₂是动植物细胞应答各种外界刺激和内源刺激的重要的信号分子，调控着植物的生长发育。随着防御机理研究的深入，人们逐渐将注意力转向诸如过氧化氢等被认为是信号传递分子的物质，研究其对逆境胁迫中植物的防护效应及作用机理，以便在植物生产中采取有效的技术措施，提高植物抗逆能力。越来越多的研究证明, 植物可以利用h₂o₂并将其放大作为信号分子, 进而调控生长发育过程和对各种生物和非生物刺激的应答。因此，用过氧化氢来研究小麦高温胁迫下生理指标的影响，对提高其品质和产量，具有重要的理论价值和现实意义。

2. 研究内容和预期目标

高温是限制植物生长、地理分布、作物产量的一种主要环境因子，无论是耐高温植物还是不耐高温植物均有可能遭受高温的伤害，高温胁迫会引起农作物产生形态异常、生化代谢紊乱。过氧化氢(Hydrogen peroxide, H₂O₂)是生物细胞代谢过程中产生的一种活性氧。越来越多的研究证明, 植物可以利用H₂O₂并将其放大作为信号分子, 进而调控生长发育过程和对各种生物和非生物刺激的应答。

本实验通过采用模拟高温实验法，选择选择小麦苗期作为实验时段，研究不同温度对小麦幼苗逆境指标的影响。主要方法是将小麦幼苗用特定高温处理，再用一系列浓度梯度的H₂0₂对高温胁迫小麦幼苗进行处理，以25℃下培养的小麦幼苗和没经H₂0₂处理的的高温胁迫小麦幼苗作为对照，测定小麦幼苗的以下生理指标：超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、可溶性糖含量、叶绿素含量和脯氨酸（Pro）含量，并作变化曲线，分析H₂O₂在小麦幼苗高温逆境胁迫过程中的作用,为探讨提高小麦的抗逆性奠定基础。本实验力求客观反映H₂O₂对高温胁迫小麦幼苗处理后可能存在的剂量效应和时间效应。

3. 研究的方法与步骤

1.小麦幼苗的处理

将小麦种子用蒸馏水洗，选取籽粒饱满的小麦种子,以75%酒精表面消毒10min,无菌水充分冲洗后于25℃培养箱中暗发芽,发芽后选择芽长一致的种子,用完全培养液置于光照培养箱中水培,温度设置为25℃/18℃(昼/夜),每天光照14h。当幼苗长至两片真叶时,选取生长一致的健壮幼苗，进行35℃连续高温胁迫处理，并添加不同浓度的H₂O₂溶液培养，按步骤测定各个逆境指标。

2.SOD活性测定——邻苯三酚自氧化法

超氧化物歧化酶(SOD)是一种含金属离子的保护酶。主要功能是催化超氧物阴离子自由基(O₂^﹣)发生歧化反应,生成H₂O₂和O₂,从而清除O₂^﹣对细胞的毒害。用测定SOD活性。

步骤：

①SOD提取： 称取0.5g小麦叶片，加入6ml磷酸缓冲液，在冰浴下研磨成匀浆，在3℃下12000r/min离心20min后，取上清液，64℃水浴中热击20min，再置于16℃下，5000r/min离心15min，取上清液即为SOD提取液。

②邻苯三酚自氧化速率测定：取5mlTris-HCl缓冲液，25℃水浴20min，加入20μl邻苯三酚试剂，于325nm下测其OD值，每30s记一次，记录3min，计算每分钟的变化速率,记为Ao。

③样品的测定：取5mlTris-Hcl缓冲液，加入20μlSOD提取液，置25℃水浴20min，加入20μl邻苯三酚试剂，325nm下测其OD值，每30s打印依一次，记录3min，计算每分钟的变化速率，记为As。

④结果计算

SOD酶活性（U/ml）=

公式中:V——加样体积（实验中为20μl）

n——样品稀释倍数（实验中稀释250倍）

0.5——抑制自氧化反应速率的50%

⑤将结果记录于表中：

⑥结果分析

3.MDA含量测定——硫代巴比妥酸法

步骤：

①MDA的提取：称取0.5g小麦幼苗叶片,加入1mL10%三氯乙酸(TCA)和少量石英砂研磨，再加入4mL三氯乙酸充分研磨,将匀浆液转入离心管,于4000r/min离心10min,上清液即为MDA提取液。

②显色反应及测定：吸取2mL提取液，加入2mL0.6%TBA液，混匀，在试管上加盖塞，置于沸水浴中沸煮15min,迅速冷却，离心。取上清液测定532nm和450nm处的OD值，对照管以2mL水代替提取液。

③结果计算：

C_MDA（μmol/L）=6.45A₅₃₂－0.56A₄₅₀

公式中：A₄₅₀——450nm波长下测得的吸光度值

A₅₃₂——532nm波长下测得的吸光度值

C_MDA——反应混合液中MDA的浓度。

提取液中MDA浓度（μmol/L）=

MDA含量（μmol/g）=

④将结果记录于表中

⑤结果分析

4.叶绿素含量测定——用叶绿素计测定

步骤：

① 叶绿素测定的整个实验过程中，需要用叶绿素计测定不同小麦叶片的同一片区域，本实验选择在距小麦幼苗叶尖2~3cm处测定。每个平行对照组选择不同的叶片测10~15次叶绿素含量，求平均值作为一个数据，每组做3个平行。

②将结果记录于表中

③结果分析

5.脯氨酸（Pro）含量测定

步骤：

①脯氨酸提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.5g，分别置大管中，然后向各管分别加入5ml3％的磺基水杨酸溶液，研磨提取，匀浆移至离心管中，在在沸水浴中提取10min，（提取过程中要经常摇动），冷却后3000r/min离心10min，取上清液待测。

②标准曲线制作：用100μg/ml脯氨酸配制成0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10μg/mL的标准溶液。取标准溶液各2mL,加2mL3%磺基水杨酸，2mL冰醋酸和4mL2.5%酸性茚三酮试剂于具塞试管中，置沸水浴中显色1h,冷却后加入4mL甲苯，盖好盖子于漩涡混合仪上振荡0.5min,静置分层，吸取红色甲苯相，波长520nm处测定OD值，以OD值为纵坐标，脯氨酸质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。

③各取2mL上清液，分别加入2mL蒸馏水，冰醋酸和4mL2.5%酸性茚三酮，与上述制作标准曲线一样进行显色，萃取和比色，最后从标准曲线查得脯氨酸含量。

④将结果记录于表中

⑤结果分析

6.可溶性糖含量的测定——蒽酮比色法

步骤：

①标准曲线制作：取适量分析纯蔗糖，80℃烘至恒重，精确称取1.000g，加少量水溶解，再转入100ml容量瓶，加入0.5ml浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度，得到的即为1%蔗糖溶液。精确吸取1ml的1%蔗糖溶液于100ml容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，得到100μg/L蔗糖标准液；取11支刻度试管，标号0~10，按下表加入蔗糖标准液和水：

再加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯溶液和5ml浓硫酸，振荡后，立即沸水浴，逐管保温1min，取出后自然冷却至室温，在630nm处测吸光度；最后以蔗糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

②可溶性糖提取：称取0.3g新鲜小麦叶片，剪碎混匀，放入具塞试管中，加入10ml蒸馏水，在沸水浴浸提30min，将提取液过滤入25ml容量瓶，再加入10ml蒸馏水，沸水浴浸提30min，提取液过滤入同一25ml容量瓶，最后漂洗，定容至刻度。

③显色：取0.5ml提取液，依次加入1.5ml蒸馏水，0.5ml蒽酮乙酸乙酯溶液和5ml浓硫酸，振荡后，立即沸水浴，逐管保温1min，自然冷却至室温，在630nm处测吸光度，记录数据。

④ 结果计算

最后通过标准曲线求出可溶性糖的含量（μg），按下方公式计算出被测小麦幼苗叶片的糖含量：

可溶性糖含量（%）=

公式中：C——标准曲线上求得的糖含量（μg）

V_总——提取液总体积（ml）

V_测——吸取样品液的体积（ml）

N——稀释倍数

W——样品鲜重（g）

⑤将结果记录于表中

⑥结果分析

4. 参考文献

[1] sminoff n．the role of active oxygen in the response of plants towater deficit and desiccation［j］．new phytologist，1993，125( 1) :27 － 31

[2] 赵萍萍.逆境胁迫下外源调节因子对小麦幼苗生长的影响[d].河南师范大学,2013.

[3] 陈小霞,李磊,牛洪斌等.高温胁迫对不同小麦品种幼苗叶片中抗氧化酶活性的影响[j].河南农业科学,2008,(12):38—40

[4] lobell d b．asner g p．climate andmanagementcontributions to recent trends in us agriculturalyields[j]．science，2003，299：1032

5. 计划与进度安排

1、2022-12-19 确定选题；

2、2022-12-26 — 2022-02-24 接受任务，完成开题准备；