重组人白细胞介素26的表达及分离纯化文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一． 研究背景

2000年,由德国Knappe A等用差减杂交的方法首次在单纯疱疹病毒(HVS)转化的T淋巴细胞里鉴定了一种新基因AK155蛋白。该蛋白是由两个受体蛋白IL-20R1( CRF2-8)和IL-10R2 ( CRF2-4)组成的异二聚体。其氨基酸序列和蛋白质空间构型上与IFN、IL-10、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24 具有一定的同源性, 它们的受体结构也具有一定的相似性, 因此这些细胞因子统归于Ⅱ型细胞因子家族成员,而该蛋白属于IL-10 家族的新成员,因此人类基因组组织(Human genome organization, HU2GO)建议将其命名为白介素26 ( Interleukin 26) ,简称IL26,并得到了白介素命名委员会的确认。

IL-26主要由单核细胞和T细胞产生,在多种免疫炎症反应和变态反应疾病过程中发挥重要作用。首先从已有数据来看,它可能参与了T细胞对HSV的免疫反应。IL-26基因在各类T细胞里以低水平正常地表达,而在HSV转化后的细胞中能充分地高水平表达。而L-26在HSV转化的人T细胞中过度表达,提示它可能在由单纯疱疹病毒(HSV)感染引起淋巴细胞转化时起重要作用;其次IL-26能结合肝素, IL-26通过PG糖附着在细胞表面,因而认为PG为IL-26的辅助受体。IL-26与肝素的亲和力能引起IL-26分泌细胞或临近细胞表面的GAG中度结合,研究进一步证明了IL-26的螺旋AB区域作为IL-26特异性肝素结合结构域,细胞表面结合的IL-26能引起局部接触依赖效应,这表明不同细胞存在于不同的PG,因而IL-26表现为细胞型特异性。此外,Igawa等研究还发现在硬骨鱼类体内存在IL-26基因,而且编码区域的5个外显子与人类处于同一个位置,这种结构的同源性被进一步证实,表明其基因表达对鱼类的免疫反应发挥着积极的作用,这种基因还是首次在哺乳动物以外被报道,对IL-26基因在体外表达有一定的提示作用。

而具推测IL-26存在6个螺旋:1）A(18aa,位于19-36aa残基位上)、B(7aa,位于47-55aa残基位上)、C(23aa,位于56-78aa残基位上)、D(20aa,位于81-100aa残基位上)、E(14aa,位于110-123aa残基位上)、F(24aa,位于125-148残基位上)。2）B螺旋内存在很多阳离子电荷,还存在4个保守的Cys残基,能形成分子内二硫键,对二聚体形成是必需的,IL-26整个分子里含30个Lys/Arg,只有12个Asp/Glu,等电点为10.70。在变性条件下,从E.coli里能成功地纯化N-末端组氨酸的标签IL-26蛋白,SDS-PAGE迁移带相对分子质量为18103;在缺乏2-巯基丙醇和预先加热时,迁移带相对分子质量为36103,进一步表明复性后偶发二聚体的形成和功能蛋白质的折叠,IL-26也能在COS-7细胞里表达,蛋白质印迹法能检测HSV转化的人T细胞系3C(CD8 )和CB-15(CD4 )裂解液里内源性IL-26蛋白。

在本实验中在IL-26的N-末端加入了6His 标签，所以我们使用金属离子亲和色谱，用HisTrap^TM-HP柱纯化。这是因为组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理进行吸附的，亲和配体（填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。而6His 标签在PH8.0时不带电，且无免疫原性，对蛋白质的分泌，折叠，功能基本上无影响，能高度亲和镍离子，用于蛋白质的亲和纯化。当然在实验时还应该注意：

1） 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团，比如：NH4，甘氨酸，精氨酸，Tris，等；

2） 各种缓冲液里不能有高浓度的强还原剂，比如DTT，防止二价Ni被还原；

3） 各种缓冲液中不能有强螯合剂，如EDTA，EGTA等；

4） 不能含离子型的去垢剂，比如SDS，防止Ni流失；