三个潜在的具有醛氧化能力基因的外源表达及对糠醛和羟甲基糠醛氧化能力的测定开题报告

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1. 研究目的与意义

氧化葡萄糖酸杆菌是工业上应用最为广泛的微生物之一，其具有独特的不完全氧化多羟基类化合物的能力，可以生成相应的醛类、酮类或酸类。在以往文献中发现，来源于氧化葡萄糖酸杆菌621H的两个假定的NAD(P)依赖型醛脱氢酶基因GOX-RS03635和GOX-RS06785具有氧化醛类为相应酸类的能力^[1]。其中，GOX-RS03635的辅酶为NAD，倾向于氧化长链的脂肪醛和芳香醛；GOX-RS06785辅酶为NADP，倾向于氧化短链的脂肪醛和芳香醛，但文献中没有报道二者是否具有氧化糠醛和5-羟甲基糠醛的能力。在以往文献中发现，黄嘌呤氧化酶是很好的催化羟甲基糠醛合成酸的催化剂，黄嘌呤脱氢酶为需氧脱氢酶，故黄嘌呤氧化酶又名黄嘌呤脱氢酶。PP-4234是来源于恶臭假单胞菌KT2440中编码黄嘌呤脱氢酶的基因 所以推测这三种基因编码的酶具有氧化醛类物质的潜力。

糠醛及5-羟甲基糠醛是木质纤维素预处理中所产生的抑制物，己糖经脱水反应后生成5-羟甲基糠醛，戊糖经脱水反应后生成糠醛^[2]。糠醛和5-羟甲基糠醛对微生物具有一定毒性从而对发酵过程造成抑制^[3] 。糠酸在塑料工业中可用于增塑剂、热固性树脂等；在食品工业中用作防腐剂；也用作涂料添加剂、医药与香料等的中间体；5-羟甲基糠酸是合成各种聚酯以及白细胞介素抑制剂的起始材料。本论文意在筛选对糠醛和5-羟甲基糠醛具有强氧化能力的酶，将这两种醛类物质氧化成毒性低的相应的糠酸及5-羟甲基糠酸。本实验为糠醛及5-羟甲基糠醛在氧化方面的研究提供了一定的基础，有利于今后的进一步研究。

2. 国内外研究现状分析

2.1糠醛和羟甲基糠醛的生物催化氧化

2.1.1糠醛的理化性质

糠醛无色透明油状液体，有类似苯甲醛的特殊气味。暴露在光和空气中颜色很快变为红棕色。易与蒸气一同挥发。由于糠醛具有醛基、二烯基醚官能团（图1），因此糠醛具有醛、醚、二烯烃等化合物的性质，特别是与苯甲醛性质相似。在一定条件下，糠醛能发生如下化学反应^[4]： 糠醛经氧化制取顺丁烯二酸、顺丁烯二酸酐、糠酸、呋喃甲酸。在气相条件下，糠醛经触媒氧化生成失水苹果酸。糠醛加氢可制取糠醇、四氢化糠醇、甲基呋喃、甲基四氢呋喃。糠醛蒸汽与水蒸汽经适当的触媒脱碳后可制得呋喃。糠醛在强碱作用下发生康尼查罗反应，生成糠醇及糠酸钠。糠醛可在脂肪酸盐或有机碱的作用下发生柏琴反应，同酸酐缩合生成呋喃丙烯酸。糠醛与酚类化合物缩合生成热塑性树脂；与尿素、三聚氰胺缩合制造塑料；与丙酮缩合制取糠酮树脂。

图1 糠醛分子结构

2.1.2糠醛的生物催化氧化

在有氧环境中，糠醛及其衍生物可由微生物将醛还原为对应的醇，即糠醛被生物转化为糠醇，5-羟甲基糠醛被生物转化为5-羟甲基糠醇，同时也可由醇被微生物氧化为对应的醛，再由醛氧化为对应的酸。即糠醇被氧化为糠醛再被氧化为糠酸，四氢糠醇被氧化为四氢糠醛再被氧化为四氢糠酸。目前已比较明朗的代谢途径是Trudgill, Koenig等人以恶臭假单胞菌为研究对象进行的糠醇、糠醛、糠酸三者代谢途径的研究。首先在糠酰CoA合成酶的作用下产生2-糠酰CoA，然后在脱氢酶的催化作用下形成糠酰CoA，由水提供所需的氧。恶臭假单胞菌还可以糠醛和糠醇为底物，经糠酸和2-糠酰CoA途径降解。糠醛好氧降解途径为恶臭假单胞菌在醛基脱氢酶的作用下将糠醛转化为糠酸。糠醛首先被氧化为糠酸，再经过一系列酶的作用断开呋喃环降解为2-氧化戊二酸，最后进入三羧酸循环被菌体代谢^[5]。

Boopathy发现多种厌氧肠道细菌在以葡萄糖、蛋白胨等作为生长基质时，能在有氧和无氧环境中将糠醛转化为糠醇，5-羟甲基糠醛转化为5-羟甲基糠醇，但并不能以糠醛或者5-甲基糠醛等作为唯一的碳源和能源生长繁殖。 Belay等人在研究产甲烷球菌属将糠醛还原为糠醇时发现，该菌并不能单独利用糠醛作为底物，当以糠醛为唯一碳源和能源时，该菌不能生长繁殖，但在有异生物质存在时，糠醛的转化可直接促进该菌的生长。表明这些菌种在降解糠醛及其衍生物时是共代谢模式。

2.1.3羟甲基糠醛的理化性质

5-羟甲基糠醛(5-HMF)是一种重要的平台化合物，可作为许多高附加值塑料和生物燃料的原材料。5-HMF可由六碳糖、低聚糖、高聚糖在酸性催化剂的作用下脱水而得。5-HMF的物理性质见表1，5-HMF的结构中因具有醛基和羟基（图2），化学性质比较活泼，可以通过氧化、酯化、聚合、加氢合成多种的衍生物和高分子材料，包括医药中间体，燃料添加物，树脂类塑料。例如，5-HMF经过氧化可生成2,5-呋喃二甲醛CDFF)、2,5-呋喃二甲酸(FDCA、乙酰丙酸(LA)。

图2 5-HMF分子结构

表1 5-HMF的物理性质^[6]

2.1.4羟甲基糠醛的生物催化氧化

随着绿色化学概念的提出，羟甲基糠醛生物催化氧化制备大宗化学品日益引起人们的关注。羟甲基糠醛的生物催化氧化主要有全细胞催化和分离酶胞外催化氧化两种。Koopman和Wierckx等利用氧化还原酶仅限用于有氧条件的特点，将C.hasileusi氧化还原酶在溶剂耐受性菌株恶臭假单胞菌 S12中表达，利用全细胞催化氧化羟甲基糠醛，能得到30 g/L的呋喃二甲酸，其呋喃二甲酸收率能达到97%，而羟甲基糠醛的转化率接近于100% ,但反应时间长达144 h。该过程虽有效的避免了胞外酶更易受到羟甲基糠醛及产物H₂O₂破坏而失活的问题，从而提高反应整体的催化效率。

2013年，Krystof等提出了使用过氧酸原位氧化羟甲基糠醛的概念。由于过氧酸氧化性强，不易储存和运输，因此其利用Baeyer-Villiger反应原理，使用脂肪醋提供酰基，与过氧化氢在脂肪酶的催化下反应生成过氧酸(图3)，氧化羟甲基糠醛，然而生成的过氧酸优先氧化醛基，而不是羟甲基^[7]。为了完全氧化羟甲基糠醛的醛基和羟甲基，研究人员使用一锅两步法，首先使用TEMPO氧化羟甲基糠醛生成呋喃二甲醛（DFF）中间体，然后利用过氧酸将DFF氧化成呋喃二甲酸，过氧酸能完全氧化DFF (50 mmol/L)生成呋喃二甲酸，其呋喃二甲酸产率能达到83%。该过程较好的实现了化学催化反应和酶催化反应的溶剂体系的兼容性。

图3脂肪酶催化过氧酸生成及其酶催化氧化呋喃衍生物

2015年，Qin等改进了Krystof实验，其利用半乳糖氧化酶(galactose oxidase, GO)氧化羟甲基糠醛生成DFF，其最高产率为91%。生成的DFF及剩余的羟甲基糠醛浓缩，利用乙酸乙酯萃取后用脂肪酶氧化最后生成呋喃二甲酸。该一锅两步氧化反应终产物呋喃二甲酸产率可达88%，略高于Krystof反应中呋喃二甲酸的产率(82%)，但是反应时间长。Mckenna等在前面研究的基础上，取得更好的结果，采用半乳糖氧化酶变体和醛氧化酶第一次实现了双酶协同一锅法氧化羟甲基糠醛制备呋喃二甲酸^[8]。

2.2氧化葡萄糖酸杆菌621 H和恶臭假单胞菌KT 2440的基因组及酶学研究

2.2.1氧化葡萄糖酸杆菌621 H基因组的一般特征

2005年，德国科学家对氧化葡萄糖酸杆菌621 H进行了全基因组测序以获取对该微生物氧化潜力更深入的了解并阐明不完全氧化的机制。其中，环状染色体全长2,702,173 bp，其G C含量为60.8%。此外，该菌株还包含5个大小分别为163.1, 26.6, 14.6, 13.2和2.7 kb的内生质粒，因此其总基因组长度为2,922,384 bp。该菌具有2,664个预测蛋白编码的开放阅读框(ORFs),四个rRNA操纵子及55个基因编码的tRNAs，预计有89.9%的DNA编码蛋白或者稳定的RNAs，其中功能基因有1,877个ORFs(占70.5%) 446个ORFs与其他菌种的假定蛋白相似，341个ORFs是G.oxydans所独有的^[9]。

在氧化葡萄糖酸杆菌基因组中有大量重复单元，参与基因组重排。已鉴定出82个插入序列和103个转座子基因。其中某些会被部分切除或可能缺失，而大多数的插入序列看起来是有功能的，它们的切除或缺失可能与基因的不稳定有关，导致在一些醋酸杆菌中生理特征的丧失。

2.2.2 氧化葡萄糖酸杆菌621 H的酶学研究

在过去的几十年中，许多重要的膜结合脱氢酶被被发现和鉴定，并且对其性质进行了研究。主要有D-山梨醇脱氢酶、L-山梨糖脱氢酶、L-山梨糖/L-山梨酮脱氢酶、古龙酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖酸脱氢酶、乙醇脱氢酶等。多数的膜结合脱氢酶都是利用PQQ作为辅基来转移还原等量物进入电子传递系统，因此那些不能合成PQQ的突变菌株将无法利用多元醇(如D-甘露醇、D-葡萄糖、甘油等)作为它们生长的能量来源。PQQ是G.oxydans 621 H利用这些多元醇生长的必需因子。

对于氧化葡萄糖酸杆菌，由于膜结合脱氢酶快速氧化短、长链醇，生成大量的醛进入细胞内，这些醛能使细胞生理代谢中的关键酶失活，或者形成能与DNA结合的诱变剂，增加了突变效率，抑制DNA的复制，这些作用严重地影响细胞正常生理代谢，细胞内的醛氧化酶和醛还原酶作用于这些多余的醛类物质，发挥它们对细胞的醛解毒作用。

2007年，Schweiger P等从氧化葡萄糖杆菌621H克隆了两个胞内的NAD (P)依赖的醛脱氢酶基因gox 1122和gox 0499，生物信息学分析预测这两个基因为琥珀酸酯半醛脱氢酶。但是作者通过实验证实它们对于琥珀酸酯半醛没有任何作用。所以对于研究氧化葡萄糖酸杆菌中未知基因的功能，不能仅仅基于生物信息学分析，甚至某些预测分析可能是错误的，这样的错误会加大对研究基因功能信息的困难，因此通过生物实验鉴定基因的功能是非常有必要的。在大肠杆菌中构建表达载体，诱导表达蛋白，分析gox 1122和gox 0499都为单聚体，gox 1122的最适底物为乙醛，辅酶为NADP，它能氧化短链的脂肪醛和芳香醛;gox 0499的最适底物为月桂醛，辅酶为NAD，它倾向于氧化长链的脂肪醛和芳香醛。醛脱氢酶家族能氧化多种内源性或外源性的醛生成梭酸，在细胞代谢发挥重要的解毒和防御作用。氧化葡萄糖酸杆菌中的这两个基因可能也会有相应的解毒功能，另外gox 0499氧化长链醛生成的脂肪酸，可作为磷脂合成的前体物质。gox 0499和gox 122底物谱非常广泛，能氧化多种脂肪醛和芳香醛，可能会有潜在的应用前景。

来源于氧化葡萄糖酸杆菌另外三个NADPH依赖的，FAD结合，NADPH依赖的胞内酶基因(gox 2107,gox 0502和gox 2684)也在2008年被鉴定，都能还原酰基类酮，醌物质。一个NADP依赖的甘油脱氢酶基因(gox 1615)也在最近被鉴定，能发生可逆反应，且高度立体选择还原甘油醛，积累L-甘油醛。在生物技术应用中有两个己被鉴定的细胞质氧化还原酶可能发挥关键作用，一个是NADPH依赖的山梨糖还原酶，能把L-山梨糖还原为D-山梨醇。D-山梨醇是工业生产维生素C的重要中间产物。在胞内，D-山梨醇被山梨醇脱氢酶氧化生成果糖进入磷酸戊糖代谢途径。另一个是木糖醇脱氢酶，把D-木糖还原为木糖醇。木糖醇可以防止龋齿及可替代蔗糖作为天然的增甜剂。

2.2.3恶臭假单胞菌KT 2440基因组的一般特征

恶臭假单胞菌KT 2440基因组在2002年被测序及解析，该菌的基因组大小6.18 Mb。在恶臭假单胞菌中是第一个被解析的，同时也是第一个被美国卫生部重组DNA委员会认定为对环境安全的革兰氏阴性菌株。2002年，Nelson KE等人研究了恶臭假单胞菌KT2440在基因组上的代谢多样性问题。2009年，Lee Y等研究出dsbA基因在恶臭假单胞菌KT 2440的细胞被膜形成过程的作用。2010年，Wig Q等发现了恶臭假单胞菌KT 2440的户相关基因的表达和产量的差异在不同的碳源条件下生长会有所差异。2011年，Martinet-Garcia E等人构建了一个恶臭假单胞菌KT 2440基因组上多片段的方法，通过对敲除菌株表现型的比较，发现相关基因之间的关系，为革兰氏阴性菌的大量基因敲除提够了相似的方法。 2013年，Graf N等人发现了恶臭假单胞菌KT 2440的一种甲乙酮诱导系统，由Ara/fXylS调节基因家族的一员mekR进行监管，在葡萄糖存在的情况下会阻遏其表达。

2.2.4恶臭假单胞菌KT 2440的酶学研究

甲醛脱氢酶(formaldehydedehydrogenase,ADH, EC 1.2.1.1) 是中等锌链醇脱氢酶家族中的一员, 存在于绝大多数原核以及所有的真核生物中, 对生物体内的甲醛解毒具有重要作用. 大部分ADH 都需要NAD和谷胱甘肽(GSH)参与甲醛的氧化作用, 而来自恶臭假单胞菌的甲醛脱氢酶(PADH)是目前发现的唯一一个不依赖GSH 参与甲醛氧化的脱氢酶。在有辅因子NAD 存在时PADH 可把游离甲醛直接氧化为甲酸, 活化形式的PADH 是一个由相同亚基组成的同型四聚体, 每个亚基相对分子质量大约为42 kD, 由398 个氨基酸残基组成, 对甲醛的Km为0.30 mmol/L。

假单胞菌属细菌代谢尼古丁的毗咯途径还不完整，2,_5一二经基毗咤(DHP)

代谢的途径还没有被揭示。Tracker等报道P. convexa降解尼古丁和尼古丁酸有共同的途径，DHP之后的代谢途径是相同的^[10]。2008年，Jimenez等解析了恶臭假单胞菌KT2440中完整的尼古丁酸代谢途径，其中DHP双加氧酶(NicX)催化DHP生成N-甲酞马来酞胺酸(NFM ) , NFM在NFM脱甲酞酶(NicD)的作用下生成马来酞胺酸，后者在马来酞胺酸脱氨基酶(NicF)的作用下生产马来酸，最后马来酸在马来酸顺反异构酶(NicE)的催化下生成富马酸，从而进入TCA循环。催化这四步反应的酶NicX, NicD,NicF和NicE的编码基因在恶臭假单胞菌KT2440的基因组中成簇排列^[11]。

2.3三种酶的氧化能力研究

2.3.1氧化葡萄糖酸杆菌两种NAD(P)依赖型醛脱氢酶

生物信息学分析显示GOX-RS03635和GOX-RS06785可能均属于醛酮还原酶家族，如DL一甘油醛，丁醛等脂肪醛，硝基苯甲醛等芳香醛，木糖，还有一些酮类物质。醛酮还原酶通常还需要辅酶才能发生反应，其中大部分的醛酮还原酶都是利用NADPH作为辅酶，少量利用NADH作为辅酶，也有一些家族成员是两种都可利用的。实验结果显示，这两种酶只利用NADPH为辅酶催化还原反应。两种酶都不能将D一葡萄糖、D一木糖等单糖作为催化底物;对于酮底物的催化作用也很微弱;但都能催化脂肪醛、芳香醛类物质^[12]。

2.3.2恶臭假单胞菌黄嘌呤脱氢酶

黄嘌呤氧化酶分子量大约为300000道尔顿，由两个150000道尔顿的无活性亚基组成^[13]。黄嘌呤脱氢酶的底物特异性不强,能作用于许多天然的或合成的嘌呤及一些芳香族和脂肪族醛类化合物^[14]。底物特性也因一般来说细菌黄嘌呤脱氢酶对次黄呤和黄嘌呤活性较强,但也有例外,如产蓝蔑视霉菌对鸟嘌呤(Guanine)活性较强。对甲基化嘌呤衍生物作用中,1-甲基黄嘌呤、3-甲基黄嘌呤等还被用于酶的生理性分类,一般,有黄嘌呤脱氢酶的需氧生长的革兰氏阴性菌，有氧化3-甲基黄嘌呤的能力,微厌氧菌无论革兰氏阴性、阳性菌都无此能力,需氧生长的革兰氏阳性菌都有氧化1-甲基黄嘌呤的能力^[15]。

黄嘌呤氧化酶/脱氢酶是生物有机体嘌呤代谢的关键酶，在嘌呤代谢途径中起着重要作用。参与细胞几乎所有生物化学过程的核苷酸在体内可先降解为核苷和磷酸。核苷在核苷酶的作用下分解为嘌呤碱基、嘧啶碱基和核糖。嘌呤可进一步分解，以代谢废物形式排出体外。但不同种类的生物分解嘌呤的能力是不一样的，代谢产物也各不相同。嘌呤碱的分解首先是在脱氨酶作用下水解脱去氨基，腺嘌呤水解脱氨生成次黄嘌呤，鸟嘌呤水解则生成黄嘌呤。次黄嘌呤和黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶/脱氢酶的作用下氧化生成尿酸。

3. 研究的基本内容与计划

2018.3.6-2018.3.20基因gox-rs06785，gox-rs03635和pp-4234编码酶的诱导表达及纯化。

2018.3.21-2018.4.5基因gox-rs06785，gox-rs03635和pp-4234编码酶对不同底物的选择性。

2018.4.6-2018.4.20筛选出对不同底物选择性最优酶并测定该酶的酶学性质。

4. 研究创新点

通过将重组质粒导入大肠杆菌诱导表达及纯化相关酶，探索来源于氧化葡萄糖酸杆菌621 H的两个假定的NAD(P)依赖型醛脱氢酶基因GOX-RS03635和GOX-RS06785编码酶氧化糠醛和5-羟甲基糠醛的能力以及来源于恶臭假单胞菌KT2440基因PP-4234编码黄嘌呤脱氢酶氧化糠醛和5-羟甲基糠醛的能力。筛选出对不同底物选择性最优酶并测定该酶的酶学性质。定量研究这三种基因编码的酶具有的氧化醛类物质的潜力。