1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）
| 海藻糖-6-磷酸合酶能够以6-磷酸葡萄糖和尿苷二磷酸葡萄糖( UDPG)为底物，经过一系列反应催化生成海藻糖，而海藻糖是生物体内一种非常典型的应激产物, 在干旱、缺氧等逆境环境下对生物体蛋白质具有特殊的保护作用。大多数生物均采用 TPS/TPP 途径合成自身所需要的海藻糖。综述了国内外海藻糖合酶的结构和功能的最新研究进展，总结了海藻糖合成酶基因 TPS1指导生成海藻糖的作用机理以及在相关领域的应用，指出了海藻糖合酶的深入研究对海藻糖的生产具有重要意义。 一些低等生物例如真菌、细菌等，TPS/TPP 途径并不是唯一的海藻糖合成途径，另外4条途径对于其海藻糖的积累同样也发挥重要作用。通常在工业上大规模化生产时，TreS法生产路线最为简单，TreS途径是通过麦芽糖作为底物一步催化生成海藻糖。这种方法的关键在于要求TreS具有高转化率和高温度、ｐＨ值耐受性,所以仍存在例如副产物的产生率增加，对于温度和PH的耐受性不够等问题，单个的来看，不同的海藻糖合成途径各有所长各有所短。在部分生物在受到强烈的胁迫时，通常会同时引发多种途径合成海藻糖，等到环境正常，胁迫解除，积累的海藻糖被分解。因此，进一步明确TPS/TPP 途径相关的分子进化机制也有利于在基因工程层面构建转基因植物，对于提高作物的抗性，适应规模化生产，提高产量增强作物品质方面有着重要的研究意义，另外对于海藻糖的工厂化生产或者对于海藻糖本身的功能研究具有重要的实践性意义 国外早在上世纪60~70年代就开始了海藻糖的研究, 尤其是在日本和欧美, 研究内容涉及海藻糖的理化性质、相关功能、作用机制及代谢途径等方面,国内对海藻糖的研究起步较晚。随着研究的深入,其在分子生物学、食品、药品、作物育种及精细化工等领域的巨大应用前景日益凸现。在现代生物技术尤其是基因工程技术发展迅猛的背景下，克隆海藻糖合成相关的酶基因，利用基因工程菌进行异源高效表达成为了一项研究热点。 在克隆利用低等生物TPS基因的同时, 人们也试图发现与利用植物体内本身固有的 TPS 基因。Blazquez等和Vogel等分别克隆得到拟南芥的TPS基因, 并使其在酵母突变体中实现功能表达，并发现外源基因的导入可以提高植物的耐受性。植物中海藻糖含量低且分离纯化方法昂贵，希望通过DNA重组技术构建基因工程菌株进行生产的相关研究克服这一困难。
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2. 研究的基本内容和问题
海藻糖在生物体内是非常常见，由两分子葡萄糖通过α,α-1,1-糖苷键连接而成，是很安全可靠的天然糖类，由于糖分子中不含有醛基，不具有还原性，是糖类性质最为稳定的双糖；与此同时由于其对生物体有着特殊的保护作用，在生长不利环境下，许多生物体会生成海藻糖来抵御外界伤害，尤其在干旱及缺氧状态下, 海藻糖可以防止生物膜蛋白质和核酸等分子的变性，从而达到保护自身的目的，所以它也是非常典型的应激产物。海藻糖普遍存在于细菌、真菌、植物以及很多无脊椎动物体内，同时由于在不同的生物体内，反应的底物和酶系大不相同，其合成途径也各不相同。迄今已发现至少 5种不同的海藻糖合成途径,分别为TPS/TPP途径、TS途径、TreY/TreZ 途径、TreP途径和 TreT途径。这五种途径中最常见的的是TPS/TPP途径。深入了解TPS/TPP途径，剖析海藻糖合成酶的作用机理，以及有关 TPS1基因的重组表达研究，为提高生物抗性，产业化大量生产海藻糖等方面奠定夯实的基础。TPS/TPP 途径进行的反应由海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synhtase,TPS) 和海藻糖6-磷酸磷酸酯酶(trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP) 两个酶共同完成（见图一）。此途径大多发生在古菌、细菌、真菌、植物和昆虫体内。与海藻糖合成相关的基因包括 TPS1 (海藻糖-6-磷酸合酶)、TPS2 (海藻糖-6-磷酸酶) 和TSL1/TPS3 (海藻糖-6-磷酸合成酶的调节亚基)，其中 TPS1 负责催化海藻糖合成的第一步反应，对海藻糖的合成具有重要作用。
待拟解决的关键问题在于：以荷花为实验材料，提取荷花中TPS1 (海藻糖-6-磷酸合酶)基因，转入并可以在酵母菌体内正确表达和积累海藻糖。克隆了TPS1基因片段，将其重组到酵母菌的表达载体上，进而转化到缺失了TPS1基因的酵母菌突变株上，再接种到含有2％葡萄糖的ura缺陷型平板上，30摄氏度的温度下培养1-2天，当菌株在培养基上正常生长，证明了TPS1基因编码区可以使酵母突变株在含有2％葡萄糖的培养基上恢复生长，即TPS1基因可以指导TPS/TPP途径合成海藻糖。3. 研究的方法与方案
实验方案：
1、采集实验所需的荷花材料；
2、进行nntps1基因酵母互补实验
4. 研究创新点
1、想要直接证明tps1基因的功能比较有难度，所以选择了间接证明，通过鉴定基因指导生成的产物从而侧面印证基因大肠杆菌海藻糖合酶基因转入并可以在植物体内表达和积累海藻糖，而克隆了tps1基因片段，将其重组到大肠杆菌的表达载体上，转化到缺失了tps1基因的大肠杆菌突变株上，再接种到含有2％葡萄糖的培养基上，菌株可以正常生长，且可以鉴定产生了一定的海藻糖，证明了tps1基因可以指导tps/tpp途径合成海藻糖。
2、完美地利用了酵母菌能力强且生长周期短，在短时间能大量繁殖的特点，足以提供实验所需，缩短了实验周期。
3、每一步酵母菌的生长情况对比明显，能肉眼直观地看出区别，简单直白。
5. 研究计划与进展
研究计划：实验于2019年7月开始，根据已有的实验材料已进行多次重复，利用第一批的突变体和载体，利用试剂盒完成了多次重复，预计于次年四月份之前完成所有的实验内容以及图片和数据的处理。
预期进展：目前已经完成了酵母菌的突变体的构建和互补载体的构建，在此基础上进行酵母菌互补实验，采用试剂盒，挑取阳性克隆转接到含有2％半乳糖的ura缺陷型液体培养基中在三十摄氏度摇床上摇动生长2天，取菌液涂抹于含有2％半乳糖和2％葡萄糖的ura缺陷型固体培养基上，理论上结果应该显示转入nntps1基因编码区可以使酵母tps基因突变株在含有2％葡萄糖的培养基上恢复生长。同时对比没有转入tps基因的空白质粒pdr196在筛选培养基上的生长情况也能看出转入了基因的酵母突变株生长更为迅速，长势良好。
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