补料对发酵产ε-聚赖氨酸的影响开题报告

1.1背景和目的

ε-聚赖氨酸（ε-poly-Lysine，ε-PL）是少数链霉菌将 L-赖氨酸单体通过 α-COOH 与ε-NH2脱水缩合而成的一种氨基酸同聚物，聚合度为 25-35。由于其抑菌谱广、效价高、安全无毒，再配合其水溶性好、对pH 广、热稳定强等特点，ε-PL 已被广泛用作食品防腐剂。

ε-PL热稳定性非常好, 即使把聚赖氨酸水溶液加热至100 e 处理30 min 或120 e 处理20 min 后, 也不会发生分解现象, 仍保持原有聚合物的长度。聚赖氨酸能够承受一般食品加工过程中的热处理,同原料一起进行灭菌处理, 免于二次污染发生。

ε-PL安全性很高，能在人体内分解为赖氨酸, 而赖氨酸是成年人体必需8 种氨基酸之一（儿童九种必须氨基酸）, 也是世界各国允许在食品中强化的氨基酸。它具有较为广谱的抑菌效果，对于大多数能够引起食物中毒与腐败的微生物有强烈的抑制作用。正是这种安全而又广谱的抑菌效果，ε-PL成为现在研究防腐剂的热门方向的重要因素。

本研究的目的：如何利用影响产物合成及细胞代谢的金属离子进行筛选的方法，从而以获得ε-PL产量更高的菌株，提升 ε-PL 发酵工艺和优化发酵结果。

1.2研究意义, 对从事食品工业的从业者而言，现代大规模的食品生产都是建立在食品添加剂基础上的，为保证食品在有效期内存放，防腐剂是不可缺少的。因为食物从原料到餐桌往往要经过一定的货架期，防腐保鲜是食品最为关键的环节。目前，国际上批准使用的食品防腐剂种类很多，但使用规模较为频繁的是化学防腐剂，化学防腐剂价格便宜并容易获得，虽然经过了严格的毒理学实验和食品安全监测，按照规定使用对人体无害，但也无益。特别是市场机制不规范，超标使用现象屡见不鲜，因此会对人体产生危害，会发生人体机理病甚至致癌。由于这些原因，微生物来源的防腐剂越来越被人重视，目前使用的微生物源防腐剂有纳他霉素（Natamycin）、乳酸链球菌素（Nisin）、ε-聚赖氨酸（ε-PL）等。ε-聚赖氨酸（ε-PL）由于其较高的安全性和广谱的抑菌性等优点，成为食品行业研究的宠儿，迄今为止，只有日本窒素公司（Chisso Corporation）形成了年产千吨级 ε-PL 的工业化生产规模，其发酵水平在 2001 年就达到了 48.3 g/L，每年仅在日本就有十几亿日元的市场份额，由于中国人口远远多于日本人口，潜在的市场价值显而易见。

1.3 应用：（1）ε-PL 在食品中的应用：ε-PL 具有很广的抗菌谱，对生长的细菌最小抑菌浓度在100 pg·ml-1 以下。ε-PL 能够引起人们广泛的关注就在于可以作为食品保鲜剂，具有抑菌谱广、水溶性好、安全性高、热稳定性好、抑菌pH 范围广等特点。ε-聚赖氨酸能在人体内分解为赖氨酸，而赖氨酸是人体必需8 种氨基酸之一，也是世界各国允许在食品中强化氨基酸。因此ε-聚赖氨酸是一种营养型抑菌剂，食用安全性高于其它化学防腐剂。

①酒精制剂：以含50％ε一聚赖氨酸的糊精粉末为基础原料，添加30％～70％的酒精，形成酒精制剂。主要用于各种蛋制品。研究发现，将无水乙醇或含水乙醇与￡一聚赖氨酸盐混合能明显抑制酵母生长。

②有机酸制剂：添加有机酸如：醋酸、苹果酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸等，添加量为0．5％～5．0％。其中￡一聚赖氨酸与醋酸对枯草芽孢杆菌有明显的抑制作用。主要用于米饭、饮料、色拉、酱类等食品。

③甘油酯制剂：甘油酯为低级脂肪酸酯，添加量为0．01％～5％。主要用于含有动物性蛋白、乳蛋白较多的食品。

④甘氨酸制剂：甘氨酸本身就是一种抑菌剂，其和ε一聚赖氨酸复合使用，协同抑菌效果更佳。甘氨酸添加量为O．O1％-10％。

（2）ε-聚赖氨酸在医药研究中的应用

ε-PL 在医药方面主要应用于药物的缓释和靶向载体。由于ε-PL 富含阳离子，与带有阴离子的物质有很强的静电作用力并且很容易通过生物膜。可以降低生物体对药物的阻力并提高药物的转运效率。还可以将ε-PL 用作某些药物的载体，这种方法已经在医疗和制药方面得到广泛的应用。ε-PL 研究表明，其在兔子和啮齿动物中，双链RNA 多聚肌甘酸－多聚胞甘酸（poly I.poly C）作为内源性干扰素诱导物是非常有效的，因此poly I.poly C可以作为抗病毒和抗肿瘤制剂。

由于ε-PL 是阳离子型高聚合物且具有很强的抗菌性和抗病毒能力，因此有望开发成抗菌纤维。将ε-PL 与海藻酸盐复合体做成缓释胶囊的包被膜，通过ε-PL 改变海藻酸盐膜的通透性，实现逐步释放内容物的目的。

(3) ε-聚赖氨酸在高吸水性树脂中的应用

本研究立足于国内外研究现状，以白色链霉菌为生产菌，通过PB设计对影响产物合成以及细胞代谢的金属离子进行筛选，然后通过单因素实验和响应面分析方法来优化发酵培养基，从而最大限度的发挥白色链霉菌代谢生产ε-PL的特性，提高ε-PL的产量。

具体研究内容如下：

1）关键金属离子的筛选。利用PB法对氯化钠、氯化钙、氯化钾、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、硫酸镁等无机盐进行设计，其中因素水平根据文献以及微生物发酵所需无机盐的一般规律进行确定。

2）利用摇瓶单因素实验，确定筛选出来的关键因子的浓度对白色链霉菌的生长和发酵生产ε-PL的影响。

3）利用响应面分析法对这些筛选出来的关键因子进行参数寻优。

4）利用摇瓶实验，研究白色链霉菌发酵72h后的菌体浓度、葡萄糖含量、ε-PL的产量等指标，与优化前的指标进行对比。

5）利用5L发酵罐进行调控，对优化后的发酵培养基进行放大实验，从而最大限度的提高ε-PL的产量。

本实验可能需要的实验仪器有：摇床、台式离心机、超净工作台、恒温培养箱、电磁炉、分析天平、铁架台、4℃电冰箱、5L发酵罐等等。

预期目标:通过金属离子对ε-聚赖氨酸的影响，结合筛选，以获得遗传性能稳定的ε-PL高产菌株，并经过响应面分析得到最佳的发酵培养基配方。为以后考察ε-PL发酵生产过程中的影响因素，寻找关键的代谢控制步骤，优化工艺参数，以期大幅度提高ε-PL产量，为实现工业化生产ε-PL提供一定的帮助。

主要研究方法：摇瓶发酵。

3.2 发酵工艺流程：斜面培养基制备→菌种的活化→关键金属离子的筛选→单因素实验确定关键金属离子的浓度→响应面分析法优化关键金属离子→摇瓶实验对比优化前后产物合成以及细胞代谢的差异→发酵罐中培养基的验证和放大实验→整理试验数据和结果进行参数分析。

3.3 研究技术路线：通过诱变遗传定向选育ε-PL高产菌株，并得到最佳培养基，以期提高ε-PL产量。

3.4 实验方法：

（1）斜面培养基制备--贝特纳斜面培养基（g/L）： 葡萄糖 10 蛋白胨 2 酵母粉 1 琼脂 15 PH 7.5 121℃ 灭菌20min

（2）菌种的活化：将保藏的菌种接种到培养基中培养,，挑选培养基茁壮的菌落,挑选其中部分菌落接种到新的培养基中培养,重复此步骤2-3次,从而得到生长良好的菌落。

（3）PB法确定关键金属离子浓度，响应面分析法（Design-Expert）优化关键金属离子

（4）摇瓶发酵：液体种子按10%的接种量接于发酵培养基中（根据情况配制），在摇床中培养72h。

（5）分析方法：总糖含量（苯酚-浓硫酸法）、还原糖含量（DNS法）、氨基氮含量（甲醛滴定法）、菌体提取（离心法）、菌体浓度(湿菌体法)、ε-PL含量（甲基橙法）。

实验主要涉及到ε-PL的分析方法。糖含量的分析方法，目前主要采用斐林试剂滴定法、还原糖测定仪、3，5-二硝基水杨酸法等测定总糖含量和还原糖含量。ε-PL含量的分析方法，目前使用最为广泛的为甲基橙法。为了使实验数据尽可能的准确，实验数据每个水平均设有两到三个平行组取其平均值，多个水平进行。

整理数据，挑出产生ε-PL含量最高的菌，获得高产菌株，并得到最佳培养基。

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