Bacillus sp. Gel-09普鲁兰酶的克隆表达及性质分析开题报告

1. 研究目的与意义

普鲁兰酶（pullulanase, ec 3.2.1.41),也称去分支酶，是一种专一性水解支链淀粉分支点的α-1,6糖苷键的葡萄糖苷水解酶，可特异性地将支链淀粉水解形成长度不同直链淀粉，是糖苷水解酶13家族成员之一。

根据底物特异性及水解产物可以把普鲁兰酶分为4种类型，分别为Ⅰ型普鲁兰酶、Ⅱ型普鲁兰酶、新普鲁兰酶和异普鲁兰酶，Ⅰ型普鲁兰酶水解普鲁兰糖和支链寡糖中的α-1,6-糖苷键同时也能水解其他多糖中的α-1,6-糖苷键同时也能水解其他多糖中的α-1,4-糖苷键的为Ⅱ型普鲁兰酶；新普鲁兰酶和异普鲁兰酶作用于普鲁兰酶中α-1,4-糖苷键分别产生潘糖和异潘糖。

在淀粉加工工业中，普鲁兰酶与糖化酶等的联合应用可有效地提高淀粉的水解效率的葡萄糖的产量，广泛地应用于高葡萄糖浆、高麦芽糖浆和干啤酒生产等应用中，是一种重要的工业酶。

2. 国内外研究现状分析

国外对普鲁兰酶的相关研究开展较早，研究范围也较为广泛，大体分为:普鲁兰酶产生菌的筛选，普鲁兰酶的提取纯化，普鲁兰酶的结构功能研究，构建产普鲁兰酶的基因工程菌四个方面。

1953年，koshland就对糖苷水解酶类的作用机制进行了深入的阐述，他认为糖苷水解酶以结构特异的方式断裂糖苷键，其异头物的活性中心相对于底物的糖苷有反转和保留两种结构。

1961年，bender和wallenfels首次通过产气气杆菌aero6acter aerogenes发酵获得普鲁兰酶,后在多种微生物中发现有普鲁兰酶产生，多为芽孢杆菌。

3. 研究的基本内容与计划

（1）提取一株实验室保存的野生菌株的基因组dna，然后利用基因扩增方法获得普鲁兰酶编码基因，通过测序确认基因序列，构建表达载体并导入宿主bacillus sp.gel-09中，从而构建得到普鲁兰酶的重组菌株。

（2）在摇瓶中培养重组菌，获得重组酶，并对该酶的酶学性质和应用潜力进行考察；（3）在此基础上，在摇瓶中对发酵条件进行初步优化，并建立3l发酵罐中重组酶的发酵工艺。

课题的进行主要分为三个方面，即普鲁兰酶的基因表达、普鲁兰酶的酶学性质分析、普鲁兰酶制备条件的优化。

4. 研究创新点

本研究以实验室保存的野生菌株，通过构建得到产普鲁兰酶的重组菌株，并对该重组菌株进行发酵工艺条件优化，确定最佳发酵工艺参数，在此基础上，对该重组菌株所产普鲁兰酶进行分离纯化和酶学性质研究，为该酶的应用奠基试验基础。