土壤微生物活性酶的发现与鉴定开题报告

1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

一、本课题意义酶是由活细胞产生的生物催化剂，高效、专一，且需要在适宜的条件下才能发挥相应的作用，酶的这些特性和各种各样的生物催化功能，对人类及其生活都有极大的影响[1]。

土壤中活性酶种类繁多，大多是从微生物中提取或由不同微生物共同作用形成，据估计，自然界中存在有1百万到1千万种微生物，而其中只有不到1%的微生物可在实验室条件下纯培养，现代分子生物学的不断发展使得微生物学研究得以纵深发展，从细胞水平、酶学水平逐渐进入基因水平、分子水平和后基因组水平，随着个体生物基因组测序的不断完成，人们获得了大量的基因资源[2]。

随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和土壤微生物学研究中的广泛应用，促进了以土壤中未培养微生物为研究对象的新兴学科宏基因组学的产生和快速发展。

2. 研究的基本内容和问题

一、研究的目标及内容本实验通过利用宏基因组的方式筛选出能分解木聚糖的酶。

主要内容为筛选出文库菌中的木聚糖酶、序列比对鉴定、木聚糖酶dna的克隆和扩增 、酶学性质研究。

二、拟解决的关键问题本实验的主要难点在于确定合理的培养基并通过涂布平板法从文库菌中筛选出可以分解木聚糖的酶、并以链霉菌作为宿主进行功能筛选。

3. 研究的方法与方案

一、研究方法及实验方案：1. 1确定培养基并筛选出文库菌中的木聚糖酶培养基：LB液体培养基（1000ml 10g胰蛋白胨、10gNaCl、5g酵母粉）LB固体筛选培养基 （1000ml 10g胰蛋白胨、10gNaCl、5g酵母粉、1.5%琼脂、0.5%木聚糖）筛选培养基（0.5%NaCl、0.5NH4No3、0.2%KH2PO4、0.03%MgSO4、0.5%木聚糖）0.1M刚果红染剂、1M NaCl溶液1.2 序列比对鉴定、木聚糖酶DNA的克隆和扩增 1.3 酶学性质研究1.3.1木聚糖酶的最适温度与热稳定性测定1.3.2木聚糖酶的最适 pH 和酸碱稳定性二、筛选技术路线1、配置培养基(配置添加0.3%木聚糖的 LB固体培养基) 稀释菌液涂板（经过试验，菌液稀释 倍数为10-4最佳），在2ml试管中加入 液体LB培养基并做梯度稀释，待平板 风干后吸取1ml稀释菌液均匀涂布于平 板上； 将涂布后的平板放入培养箱中培养3d并观察； 用刚果红染色30min后，用NaCl脱色 20min一次直至洗脱液为无色，观察是 否有透明圈2、在24孔筛选培养基中加入1ml液体筛选培养基，加入50ul文库菌液、培养3d并观察是否有浑浊、记录浑浊细菌编号，涂板验证； 三、可行性分析 目前处于筛选阶段、可行性有待持续 实验论证。

4. 研究创新点

1、微生物中存在大量酶，而通过分离纯化的方式很难获得大量具有应用价值的活性酶。

本实验采用宏基因组学的方法进行研究，通过直接从土壤样品中提取全部微生物的dna，构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究土壤样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。

2、根据历来文献分析、一般筛选木聚糖酶时采取涂板法依次从文库菌中筛选菌落，此种方法结果较为准确但筛选样本量及操作繁琐，故本实验采取筛选培养基与透明圈培养基相结合的方法进行实验，筛选培养基准确性差但可增加样本量，而后用疑似菌在透明圈培养基上涂抹以验证。

5. 研究计划与进展

一、研究计划1个月筛选出可以分解木聚糖的酶；1个月内完成DNA测序及比对、木聚糖酶DNA的克隆和扩增及酶学性质研究。

二、预期进展目前处于筛选文库菌阶段，后续工作视筛选情况逐步进行。