微生物天然产物的分离纯化与结构分析开题报告

本课题的意义、国内外研究概况、应用前景等（列出主要参考文献）

本课题意义：微生物是产生天然生物活性物质的重要资源，其开发利用一直备受各国重视，而其中研究较多的是放线菌,迄今所发现的20,000余种微生物来源的生物活性物质中，约有50%是由放线菌产生的。其中又以链霉菌属产生的生物活性物质最多。天然产物中包含的成分复杂，有的达到几十种甚至上百种，但是每种成分含量极微。对天然产物中化学成分的提取、分离一直是一项十分艰巨的工作，提取分离方法不同，其有效成分含量乃至功能也会相差很大，甚至影响其在医疗、保健作用中的功效。因此为了有效、合理地利用天然资源，对天然产物有效成分的提取分离及分析研究就显得十分必要。本课题希望用微生物在适当培养基中以合适方式培养，经分离纯化，液相分析最终得到目标物质。

国内外研究概况：Cai 等^[1]从 Streptomyces mediocidicus ATCC23936 中分得 2 个由五烯片段和氧代三烯片段组成的化合物 mediomycins A（1）andB（2），对酵母和菌丝致病菌具有较好的抗真菌活性，其中化合物 2 的活性最强（MIC＝1～2 μg/m L）。羧基甲基化后，其抗真菌活性消失，提示该羧基为必需的药效基团。 Wang 等^[2]采用全细胞靶点筛选法和生化分析方法，从一株采自南非的普拉特链霉菌 S. platensis中分得一强效抗生素平板霉素（platensimycin，3），该化合物通过抑制Ⅱ型长链脂肪酸合成通路中的Fab F 酶发挥抗革兰阳性菌广谱体外活性，并且与耐甲氧西林金葡萄球菌（MRSA）、中度耐万古霉素金葡萄球菌（VISA）、耐万古霉素肠球菌（VRE）无交叉耐药性。此外用感染了金黄色葡萄球菌的小鼠模型对平板霉素进行体内活性评价，结果显示出强效的杀菌能力且无毒性作用。随后，同一课题组^[3]从采自西班牙的普拉特链霉菌中分离得到另一强效广谱抗生素平板素（platencin，4），其作用机制是同时抑制Ⅱ型长链脂肪酸合成通过中的 2 种合成酶Fab F/Fab H，比化合物 3 更有优势。同样对 MRSA、VISA、VRE 等临床耐药菌株有杀伤作用，在针对动物的药效研究中，亦未发现该抗生素产生任何的毒害作用。因此，化合物3和4有望成为有临床应用潜力的抗革兰阳性耐药菌抗生素。Manam 等^[4]从S. nodosus（NPS007994）分离得到氮-四烯-螺-β-内酯-γ-内酰胺抗生素 lajollamycin（5），对耐青霉素肺炎链球菌菌株和 MRSA 具有较强的抑制活性（MIC 分别为 5 和 1.5 μg/m L）。Motohashi 等^[5]从Streptomyces sp. KO-3988 分离得到的二萜化合物oxaloterpin A（6）含有奇特的 N-乙酰-N-羟基草酰胺片段，化合物 6 对枯草杆菌 Bacillus subtilis ATCC 43223 和金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ATCC 具有良好的抑制活性（IC50分别为 1.9 和 3.7 nmol/m L）。 FK506 是从 S. tsukubaensis 中分离得到的大环内酯类化合物，具有抑制 HIV-1 在 T 细胞中复制的作用^[6]，亦可抑制痘苗病毒在 BSC-40 中复制（IC50＝12.5 μmol/L）^[7]。 K-41（7）是由 S. hygroscopicus 产生的聚醚单糖苷衍生物^[8]，对氯喹耐药株Plasmodium falciparum K1 和敏感株 FCR3 具有较好的体外抗疟活性（IC50分别为 8.5和31 nmol/L），另对 P. berghei N（敏感株）和 P. yoelii ssp. NS（氯喹耐药株）感染的鼠亦有较好的治疗作用。因此，K-41 是具有临床应用潜力的新型口服抗疟药物的先导化合物。Na等^[9]从一株海洋链霉菌属微生物 Streptomyces sp. H668 中分得另一具有抗疟活性的聚醚天然产物（8），体外对氯喹敏感株 P. falciparum D6 和耐药株P. falciparum W2 的 IC50值在 100～200 ng/m L，且在4.75μg/m L 的浓度时对正常的 Vero 细胞无细胞毒作用，提示该化合物对疟原虫具有高度的特异性。化合物 1～8 结构式见图1。

从澳大利亚北领地中的蕨形叶银桦树 Grevillea pteridifolia 中分离得到一株内菌 Streptomyces sp. NRRL30566。该菌株产生的 kakadumycin A 具有广泛的抗生活性^[10]，尤其是针对革兰阳性菌，表 现出比 echinomycin 更好的活性，如对于炭疽芽胞杆菌 Bacillus anthracis，kakadumycin A 的 MIC 为0.2 ～ 0.3 μg/mL ，而 echinomycin 则为 1.0 ～ 1.2 μg/m L。此外，kakadumycin A 亦有强效的抗疟活性，抗 P. falciparum 的 IC50为（7.040.12）ng/m L。

应用前景：近年来在植物保护方面,微生物次生代谢产物的发展势头正在加快,并且这些代谢产物对于化学防治来说也是一种补充或替代。由于次生代谢产物是生物体产生的,所以它们对靶标生物体有很强的选择性,因此对有益微生物几乎没有影响。此外,像有机化合物一样,这些代谢产物可生物降解,在自然界中不积累,对环境安全。目前人们对它们兴趣浓厚,己有数种植物病害采用微生物代谢产物进行防治。微生物代谢产物拥有巨大的优势,被认为是植物病害防治策略中强有力的选择。代谢产物主要有以下优点可以克服人工杀虫剂所带来的抗药性和污染这一弊端。因为是由活细胞产生,所以其可被持续生产。只要产生代谢产物的微生物被培养,就能源源不断地生产代谢产物。大规模进行次生代谢产物的合成十分简单,因此可工业化生产。可以通过优化营养参数来提高微生物代谢产物的产量,如通过利用更便宜的基质如农业废物等方式。使代谢产物的范围在经济成本可行的情况下得到增长。由于大部分具有农药活性的代谢产物都是在自然竞争的环境下产生,所以其活性更优于化学合成的农药。微生物产生的具有农业活性的代谢产物大部分都是有机物质,所以它们最终会在自然界中进行生物降解,故不会对环境造成危害。

目前已经从微生物及其代谢产物中提取出数量可观、结构新颖的生物活性物质，包括菇类、不饱和脂肪酸、有机酸、多肤、环肤、生物碱、大环内脂类、聚醚类、酞胺类、毒素、多糖、酶类等，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、酶及酶的抑制活性等多种生物活性作用。近年来研究表明，部分微生物次生代谢产物具有强心、降压、调节血脂、溶栓、缓解心绞痛及降低胆固醇等多种心血管活性;在心血管系统疾病的机理研究、防治药物的开发等方面显示出良好的应用前景。

[1] Cai P, Kong F, Ruppen M E, et al. Polyene antibiotics from Streptomyces mediocidicus [J]. J Nat Prod, 2007, 70(2): 215-219.

[2] Wang J, Soisson S M, Young K, et al. Platensimycin is a selective Fab F inhibitor with potent antibiotic properties [J]. Nature, 2006, 441(7091): 358-361.

[3] Wang J, Kodali S, Lee S H, et al. Discovery of platencin,a dual Fab F and Fab H inhibitor with in vivo antibiotic properties [J]. Proc Natl Acad Sci U.S.A, 2007, 104 (18): 7612-7616.

[4] Manam R R, Teisan S, White D J, et al. Lajollamycin, a nitro-tetraene spiro-β-lactone-γ-lactam antibiotic from the marine actinomycete Streptomyces nodosus [J]. J Nat Prod, 2005, 68(2): 240-243.

[5] Motohashi K, Ueno R, Sue M, et al. Studies on terpenoids produced by actinomycetes: oxaloterpins A, B, C, D, and E, diterpenes from Streptomyces sp. KO-3988 [J]. J Nat Prod, 2007, 70(11): 1712-1717.

[6] Briggs C J, Ott D E, Coren L V, et al. Comparison of the effect of FK506 and cyclosporin A on virus production in H9 cells chronically and newly infected by HIV-1 [J]. Arch Virol, 1999, 144(11): 2151-2160.

[7] Reis S A, Moussatche N, Damaso C R. FK506, a secondary metabolite produced by Streptomyces, presents a novel antiviral activity against Orthopoxvirus infection in cell culture [J]. J Appl Microbiol, 2006, 100(6): 1373- 1380.

[8] Otoguro K, Ishiyama A, Ui H, et al. In vitro and in vivo antimalarial activities of the monoglycoside polyether antibiotic, K-41 against drug resistant strains of Plasmodia [J]. J Antibiot, 2002, 55(9): 832-834.

[9] Na M, Meujo D A, Kevin D, et al. A new antimalarial polyether from a marine Streptomyces sp. H668 [J]. Tetrahedron Lett, 2008, 49(44): 6282-6285.

[10] Castillo U, Harper J K, Strobel G A, et al. Kakadumycins,novel antibiotics from Streptomyces sp NRRL 30566, anendophyte of Grevillea pteridifolia [J]. FEMS MicrobioLett, 2003, 224(2): 183-190.

研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析

第一步 发酵。先用R-5培养基养种子3-5天，转大瓶Isp4培养基10-12天28摄氏度 转数225

第二步 上柱分析。树脂用水洗法把培养基洗掉，用纱布把树脂过滤掉，晒干彻底，用100％甲醇泡，把上清液树脂用旋转蒸发仪蒸干，得到粗产物。上硅胶柱，用200-300目柱子，先用少量甲醇溶解样品，用硅胶粉拌样，后用样品的10-20倍硅胶粉充柱，硅胶柱直径2.5cm，高度10-25cm，最后加一层干净硅胶粉，顶部再加一层棉花。然后先用二氯甲烷和甲醇梯度洗脱。收集滤液后蒸干。每个样品在硅胶毛细管点样（层析缸展开剂是二氯甲烷：甲醇10:1的溶液）

第三步 上液相，二次分离

第四步 质谱分析

特色或创新之处

本实验在正式实验之前，做了多次预实验确定了目标产物出现的大致梯度，提高了实验效率。

运用液相进行辅助分析，提高了实验精确度。